高血糖對大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經細胞凋亡及GRP 78表達的影響

盧俊江 胡泳濤 李艷 方毅敏 韓江全△

(1.廣州市胸科醫院結核內科，廣東 廣州 510000；2.遵義醫學院第五附屬(珠海)醫院神經內科，廣東 珠海 519100；3.廣州市胸科醫院醫務科，廣東 廣州 510000)

腦梗死是神經系統常見病和多發病，其致殘率高，嚴重影響患者生活質量，加重社會負擔。大約有三分之一的腦梗死患者發病時血糖水平升高[1]，近年來，我國糖尿病發病率一直增加，在高血糖的情況下，腦缺血發展更快更嚴重，但高血糖加重腦缺血組織損傷的機制仍不明確。細胞凋亡已被公認其在高血糖加重腦缺血損傷過程中起重要作用[2]，既往對于細胞凋亡，主要聚焦于線粒體通路及死亡受體通路，新近研究則顯示，內質網途徑同樣起著關鍵的作用。caspase-9、caspase-12是caspase家族的重要成員，是內質網通路導致凋亡的關鍵因子，在缺血缺氧、Ca2+平衡失調等各種刺激過長過強時，Caspase-12前體被大量激活，并從內質網轉移至細胞胞漿，依次激活凋亡啟動因子Caspase-9引發caspase蛋白水解級聯效應，發生細胞凋亡。而葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)在應激情況下，則解除對未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)通路蛋白的抑制，而使內質網達到穩態。GRP78在應激條件下，一方面對細胞起保護作用，另一方面亦可作為內質網應激的敏感標記物。本實驗通過研究高血糖對大鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡及GPR78表達的影響進一步探討高血糖加重腦缺血損傷的機制。報告如下。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 健康雄性SD(SpragueDawley，SD)大鼠30只，8～9周齡，體質量250～300 g，由遵義醫學院珠海校區中心實驗室提供。隨機分為3組：高血糖組、正常血糖組、假手術組，每組10只。

1.2實驗方法

1.2.1高血糖大鼠模型的制備 大鼠實驗前禁食12 h，自由進水。高血糖組于造模前30 min按體質量4 g/kg經尾靜脈注射25%(質量濃度)葡萄糖，造成高血糖狀態。正常血糖組和假手術組注射等量18%(質量濃度)D-甘露醇。于栓線前測定鼠尾血糖水平。

1.2.2局灶性腦缺血再灌注模型的制備 采用Longa線栓法[3 ]建立大腦中動脈阻塞缺血再灌注模型，均阻斷右側大腦中動脈。假手術組不阻斷右側大腦中動脈，余操作與其他組相同。

1.2.3神經功能評分 參照Zea-Longa 5分制評分標準[4]，于缺血2 h再灌注24 h對大鼠進行神經功能評分，2分或2分以上者為造模成功。

1.2.4細胞凋亡檢測 取材視交叉后2 mm處平面組織進行切片，片厚5 um。TUNEL染色步驟按試劑盒說明書進行(武漢博士德公司產品)。陽性標準：光鏡下觀察細胞核呈棕黃色者為TUNEL染色陽性細胞。根據大鼠腦缺血半暗帶的定位方法，將大腦中動脈阻塞的同側額頂葉皮質上部界定為半暗帶的等值觀察區。高倍鏡下(400倍)隨機分別觀察頂葉皮質缺血半暗區不重疊的5個視野，計算TUNEL陽性細胞平均數。

1.2.5免疫組化法檢測細胞凋亡相關 caspase-12、caspase-9表達 組織切片經60℃的恒溫箱烘120 min拷片后脫蠟；經二甲苯脫蠟，至無水酒精至95%酒精至85%酒精至70%酒精至蒸餾水洗滌濕化；再經3%H2O2室溫孵育后pH6.0的0.01M枸櫞酸鹽緩沖液中微波修復抗原，pH7.4的PBS洗滌；5%BSA室溫封閉，分別滴加兔抗caspase-12Rabbit mAb或caspase-9Rabbit mAb，4℃冰箱孵育過夜后，pH7.4的PBS洗滌；生物素化山羊抗兔IgG1 37℃孵育30 min后PBS洗滌；鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，37℃孵育及PBS洗滌；DAB顯色，室溫條件顯微鏡下顯色；蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化1～2 s后水洗返藍；酒精脫水，二甲苯透明，封片。以PBS代替一抗作陰性對照；細胞胞漿著色呈棕黃色為陽性結果。圖像選取及分析方法：MICRO-COSMOS MiVnT顯微生物圖像分析系統在統一光飽和度、亮度和色調條件下對所拍攝照片進行圖像分析。取吸光度值計算平均數，用于各組間比較。

1.2.6Western-blotting檢測GPR78表達 大鼠迅速斷頭取腦，冰上分離缺血側頂葉大腦皮質約100 mg，冰上研磨組織后加預冷的蛋白裂解液，繼續碾磨至液態，然后4℃，12 000 r/min離心30 min，留上清液，取40uL用BCA法進行蛋白定量測定，所剩上清液按4：1的比例加變性loading，100℃水浴10 min。取蛋白樣品(40μg)采用10%SDS。PAGE 100 V垂直電泳(Bio-Rad)垂直板式電泳槽儀，(USA)120 min進行分離，然后轉至硝酸纖維素膜(PVDF)上進行免疫反應(200V，120 min)。5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，然后依次加入兔抗GRP78抗體(北京博奧森生物制劑有限責任公司，1：500)，37℃孵育2 h，4℃過夜；偶聯辣根過氧化物(HRP)羊抗兔IgG(稀釋濃度1:2 000)室溫孵育2 h，LumiGLO(20×)發光劑中X一感光盒內曝光。以上反應均在塑料袋內進行，其間用PBS充分洗滌。為了檢測蛋白裂解/轉移的變化，所有的印跡均以麗春紅(抗體孵育前)和考馬斯亮藍(化學發光法檢測后)染色。膠片進行掃描和拍照，Quantity One圖像分析軟件進行蛋白量定量分析，以V值=GRP78蛋白定量/內參(β-actin)蛋白定量為結果，并進行統計學分析。

2 結 果

2.1腦缺血/再灌注后神經功能評分 假手術組大鼠神經功能評分為0分，其余兩組在大鼠麻醉清醒后即出現不同程度神經功能缺損，與假手術組比較，缺血再灌注后的高血糖組與正常血糖組評分均升高,差異有統計學意義(P<0.05)，高血糖組功能評分較血糖正常組高。差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組TUNEL陽性細胞及凋亡比較 光鏡下假手術組可見少量凋亡細胞(細胞核內可見棕黃色顆粒)，正常血糖組及高血糖組缺血側壞死灶周圍可見較多凋亡細胞。與假手術組比較，正常血糖組和高血糖組凋亡細胞數明顯增多,差異有統計學意義(P<0.05)，且高血糖組凋亡細胞較正常血糖組增多,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A:假手術組；B:正常血糖組24 h；C:高血糖組24 h；圖中棕黃色染色為凋亡細胞形態。圖1 腦缺血再灌注后TUNEL染色(TUNEL,10×40)

2.3各組大鼠caspase-9和caspase-12表達 假手術組可檢測到少量caspase-9，而caspase-12無表達。再灌注24 h后正常血糖組及高血糖組缺血側頂葉皮質可見caspase-9和caspase-12表達明顯增強。與假手術組比較，正常血糖組和高血糖組的caspase-9和caspase-12免疫組化染色灰度值均顯著增高,差異有統計學意義(P<0.05)，且高血糖組的caspase-9和caspase-12免疫組化染色灰度值較正常血糖組明顯增高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖2、圖3。

表1 大鼠神經功能評分、凋亡細胞數及caspase-9、caspase-12表達水平比較

注：A:假手術組；B:正常血糖組24 h；C:高血糖組24 h；假手術組中未見表達，正常血糖組組可見明顯棕黃色細胞數目，而高血糖組表達明顯高于正常血糖組圖2 腦缺血/再灌注caspase-12免疫組化染色(IHC,20×40)

注：A:假手術組；B:正常血糖組24 h；C:高血糖組24 h；假手術組中少量表達，正常血糖組組可見明顯棕黃色細胞數目，而高血糖組表達明顯高于正常血糖組圖3 各組腦缺血/再灌注caspase-9免疫組織化學染色(IHC,20×40)

2.4鼠腦缺血/再灌注GRP78表達的變化 正常血糖組3 h表達升高，12 h時達到高峰，24 h 仍可見明顯表達，高血糖組低于同時間點正常血糖組(P<0.01)。見表2、圖4。

表2 大鼠再灌注后不同時間GRP78水平比較

圖4 各組腦缺血/再灌注Western-blot

3 討 論

高血糖是腦血管疾病發展和加重的重要危險因素，其損傷機制目前仍未明確，現有研究表明[5-7]，可能與興奮性氨基酸的神經毒性、自由基生成增加、介導炎癥反應和誘導細胞凋亡有關。其中，細胞凋亡在高血糖加重腦缺血再灌注損傷的眾多機制中起著重要作用。研究發現:線粒體通路、死亡受體通路和內質網通路等至少3條信號轉導通路參與了凋亡[8]。腦缺血再灌注后神經細胞內質網應激反應是一個復雜的多因素過程，既有促進凋亡的caspase-9、caspase-12等因子的激活，也有抑制因子如GRP78等的變化[9]。本研究結果顯示，與正常血糖組比較，高血糖組神經功能評分及凋亡細胞數顯著增多。

凋亡是機體的一種生理過程，正常情況下有利于維持自身穩定，但異常增加則是某些損傷因素導致細胞死亡的主要形式。凋亡的機制在進化中由Caspase家族蛋白酶執行，caspase-9、caspase-12是caspase家族的重要成員，是內質網通路導致凋亡的關鍵因子，在缺血缺氧、Ca2+平衡失調等各種刺激過長過強時，Caspase-12前體被大量激活，并從內質網轉移至細胞胞漿，依次激活凋亡啟動因子Caspase-9引發caspase蛋白水解級聯效應，發生細胞凋亡。在本實驗中，正常血糖組各時點的凋亡指數、Caspase-12及其下游的Caspase-9表達較假手術組均明顯增高，提示Caspase-9、Caspase-12在誘導腦缺血再灌注后的凋亡反應中起著重要作用。

GRP78是一種內質網伴侶蛋白，生理情況下，其在真核生內質網膜上與新生多肽短暫結合后分離，從而促進蛋白質的正確折疊和裝配，故在生理狀態下有微弱表達。腦缺血再灌注損傷時，激活了內質網應激，發生UPR(unfolded protein response,未折疊蛋白反應)。在應激早期，UPR誘導 GRP78大量表達，與內質網中錯誤折疊和未折疊蛋白結合，以恢復蛋白質的正確構象，使蛋白質能夠在應激狀態下繼續正確合成，以維持內環境穩定，適應應激[10]。

在腦缺血再灌注后，內質網長時間過強應激則發生細胞凋亡，GRP78的表達呈下降趨勢[11,12]。Tajiri等認為[13]，長時間的內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，導致內質網功能失代償，細胞啟動內質網相關凋亡程序的結果。GRP78后期表達下降，神經細胞凋亡嚴重，Vilatoba等在其實驗中同樣得到驗證[14]。在本實驗中，GRP78假手術組有少量表達，正常血糖組再灌注后3 h可見少量表達，高于假手術組，并在再灌注后12 h時達高峰，后期逐漸下降，與之前的實驗相一致。

無論是動物實驗[15]，還是臨床資料[16]，都表明高血糖會加重缺血再灌注后的腦損傷。本實驗中，高血糖組的神經功能評分及凋亡指數均高于正常血糖同時點組，提示高血糖狀態下，凋亡更為嚴重，亦證實了細胞凋亡在高血糖加重腦缺血再灌注損傷中的作用。在腦缺血再灌注后，正常血糖組GRP78的表達水平均明顯高于同時點高血糖組，提示在高血糖狀態下GRP78的保護作用被明顯抑制，而且可能在應激的早期這種抑制就已形成，說明高血糖在腦缺血再灌注后一方面抑制細胞內質網應激的保護機制，另一方面促進應激反應向凋亡轉化。

綜上所述，本研究結果顯示，與正常血糖組大鼠相比，高血糖組大鼠腦組織，大鼠神經功能缺損更嚴重，神經細胞凋亡明顯增多，高血糖組caspase-9、caspase-12表達比正常血糖同時點組均有明顯增高,差異有統計學意義(P<0.05)，且與凋亡情況變化一致，提示上調caspase-9、caspase-12表達，可能是高血糖加重腦缺血再灌注損傷的機制之一。但GPR78的表達減少，提示高血糖可增加缺血再灌注后腦細胞凋亡，GRP78可能參與了高血糖加重腦缺血再灌注損傷過程，下調GRP78表達可能是高血糖加重腦缺血再灌注損傷的機制之一。