無創DNA 聯合血清AFP、uE3 及β-HCG 檢測在二胎高齡產婦產前篩查唐氏綜合征的應用價值

黃曉彬，林佳燕，楊瑋莉，吳潔如

（1.揭陽市榕城區婦幼保健計劃生育服務中心 檢驗科，廣東 揭陽 522000；2.揭陽市榕城區婦幼保健計劃生育服務中心 產前診斷中心，廣東 揭陽 522000；3.揭陽市榕城區婦幼保健計劃生育服務中心 婦產科，廣東 揭陽 522000）

0 引言

唐氏綜合征（DS）又稱為21-三體綜合征，是新生兒中較為常見的染色體異常性疾病，以嚴重的先天性智力障礙和特殊面容為主要特征，對兒童的學習、生活和生長發育均具有嚴重的影響[1]。產前診斷是及時發現DS 并預防DS 患兒出生的有效方法。羊膜穿刺后染色體檢查結合臨床癥狀是國內外用于DS 診斷的金標準，但對孕婦具有一定的侵入性，且操作復雜，不適合廣泛推廣。目前在對DS 進行產前篩查中，最常見的是血清學篩查，通過抽取產婦的血清，檢測甲胎蛋白（AFP）、游離雌三醇（uE3）和絨毛膜促性腺激素（β-HCG）濃度來對DS 進行篩查試驗，但仍存在假陽性率高的特點，無法在實際篩查過程中取得滿意的效果。近年來，無創DNA 檢測在DS 篩查和診斷中應用逐漸受到關注。無創DNA 檢測可通過對產婦外周血中胎兒的DNA 片段進行測序，提高DS 檢測的準確性[2]。本次研究通過分析無創DNA 聯合血清AFP、uE3 及β-HCG 檢測在二胎高齡產婦產前篩查DS 的應用價值，為提高DS 篩查的準確率，減少誤診和漏診的發生具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年3 月至2020 年3 月在我院進行建卡和常規產檢的二胎高齡孕婦180 例為研究對象，年齡35～48 歲，平均（40.75±4.82）歲，孕周15～21 周，平均（18.03±1.72）周。本研究經過我院醫學倫理委員會審核批準。

納入標準：①二次單胎妊娠；②年齡≥35 歲；③1 年之內未接受過異體輸血；④4 周之內未接受過引入外源DNA 的免疫治療、干細胞治療等；⑤孕產婦染色體正常；⑥孕婦及家屬知情同意并自愿參與研究。排除標準：①有DS 家族遺傳史；②孕期高血壓、糖尿病和慢性心腦血管疾病者；③胎兒超聲檢查有水囊腫；④嚴重的心、肝、腎等器質性疾病；⑤吸煙、飲酒等不良生活方式；⑥精神紊亂或意識障礙，不能配合檢查；⑦信息資料不全。

1.2 方法

（1）無創DNA 檢測。采集5mL 孕婦外周血。4℃1600g 離心10min，分離血漿，再行4℃16000g離心10min 去除殘余細胞，抽取血漿3mL，置于離心管內-80℃保存。提取血漿中游離DNA，在血漿游離DNA 片段的兩個末端加上接頭，構建DNA文庫。Illumina 新一代測序技術測序，利用專利的芯片，制備DNA 簇，邊合成邊測序，自動讀取堿基，數據被轉移到自動分析通道進行二次分析，根據公式：某染色體含量（%Chr N）＝某染色體惟一序列讀取數／參考序列染色體N 上基因組惟一序列總數；測試樣本Chr N 的關聯Z-Score=（%Chr N 檢測樣品-% Chr N 對照組平均值）/S.D.% Chr N 對照組，計算每條染色體的Z-Score值。Z-Score 值≥3 為非整倍體高風險標本，-3＜Z-Score 值＜3 為非整倍體低風險標本。

（2）血清學檢測。在規定孕周內采取靜脈血2-3mL，3000r/min 離心10min，分離血清置于-20 ℃冰箱，于5 個工作日內檢測。采用 DELFIA 時間分辨熒光法及配套的甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、游 離 絨 毛膜促性腺游素（free β-human chorionic gonadotropin，free-β-HCG）雙標試劑及游離雌三醇（unconjugated estriol，uE3）試劑盒，于1 周內測定孕婦血清標記物 free-β-HCG、uE3、AFP 的生化值。DS 高風險判斷標準：DS 和神經管缺陷（NTD）風險≥1:270 為高風險或18－三體綜合征（ES）≥1:350 為高風險。

（3）羊膜穿刺后染色體檢測。對無創DNA 檢測和血清學篩查中任何一種方法判斷為DS 高危的孕婦，在其知情同意情況下行羊膜穿刺，進行羊水細胞培養和染色體核型分析，陽性者建議終止妊娠，陰性者繼續追蹤隨訪，定期產檢復查B 超，直至胎兒出生。

1.3 觀察指標

以羊膜穿刺后染色體檢測結果為金標準，判斷無創DNA、血清學指標以及無創DNA 聯合血清學指標篩查DS 的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。

1.4 統計學分析

采用IBM SPSS 25.0 軟件進行統計學分析，連續性變量采用（均數±標準差）描述，t檢驗進行分析；分類變量采用[n（%）]描述，χ2檢驗進行分析。受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）分析篩查效能。所有統計以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 單一和聯合指標篩查二胎高齡孕婦DS效能比較

無創DNA、血清學檢測、聯合檢測篩查二胎高齡孕婦DS 的敏感性分別為87.50%、82.35%和96.15%，三種方法檢測敏感度、陽性預測值差異有統計學意義（P ＜0.05），聯合檢測的敏感度、陽性預測值較單一指標檢測高。但三種方法在特異性、陰性預測值上差異無統計學意義（P ＞0.05），見表1。

表1 單一和聯合指標篩查二胎高齡孕婦DS效能的比較

2.2 ROC曲線分析三種篩查二胎高齡孕婦DS效能比較

無創DNA、血清學檢測、聯合檢測在篩查二胎高齡孕婦DS 的AUC 分別為0.758、0.733 個0.893。三種方法篩查二胎高齡孕婦DS 的AUC 差異有統計學意義（P ＜0.05），聯合檢測的AUC 較單一指標檢測高，見表2。

表2 ROC曲線分析篩查二胎高齡女性唐氏綜合征效能

3 討論

DS 是臨床上最常見的以染色體異常為特征的遺傳性疾病，活產兒中發生率約為0.13%-0.17%[3]?；加蠨S 的患兒60% 在宮內即可發生早期流產，存活下來的患兒多伴有智力低下、生長發育遲緩、特殊面容等，給患兒自身、家庭以及社會均帶來嚴重的負擔[4]。因此，對孕婦實施及時有效的產前DS 篩查對預防和減少DS 發生具有重要意義。

高齡產婦是指年齡超過35 歲或受孕時已超過34 歲的孕婦，據研究統計，高齡孕婦DS 患病率明顯增加[5]。女性超過35 歲后，生理機能開始下降，此時進行受孕分娩，容易導致異常胎兒和不良妊娠結局的發生。我國母嬰保健法中也明確規定，對年齡高于35 歲的孕婦在妊娠中期實施產前診斷從而避免DS 患兒的出生。近年來，二胎政策的開放，使得高齡二胎孕婦人數逐年增加，對高齡二胎孕婦的DS 篩查成為了母嬰保健領域的熱點問題。

無創DNA 篩查通過采集孕婦靜脈血對胎兒游離DNA 進行測序，分析測序結果和染色體信息，篩查DS 發生風險結果準確性更高，多項研究發現無創DNA 篩查DS 的準確率可高達97.3%-100.0%[6]，但在臨床實際應用中，由于測序數據分析復雜，受母體血漿DNA 片段波動干擾等影響，也容易造成誤診和漏診。而血清學篩查具有無創、經濟實用和高接受性，逐漸成為DS 篩查的常用檢測手段，但仍具有很多的局限，如孕婦的體重、既往不良孕產史等可對檢查結果造成一定的干擾，假陽性率較高。因此聯合無創DNA 和血清學指標在二胎高齡產婦DS 篩查中應用的意義重大。本次研究中，聯合檢測的敏感度、陽性預測值較單一指標檢測高（P ＜0.05）。聯合檢測綜合兩種篩查方法的優點，可降低假陽性率，提高陽性預測值，從而提高DS 篩查的準確性，為優生優育和提高我國人口質量提供助力。

ROC 曲線分析中，無創DNA、血清學檢測、聯合檢測在篩查二胎高齡孕婦DS 的AUC 差異有統計學意義（P ＜0.05），聯合檢測的AUC 較單一指標檢測高，提示無創DNA 聯合血清學指標篩查DS 效果更好。在實際應用中，可結合衛生經濟學指標合理選擇篩查方法，提高對二胎高齡孕婦DS篩查的準確率。

綜上所述，無創DNA 聯合血清AFP、uE3 及β-HCG 檢測可提高二胎高齡產婦唐氏綜合征篩查的準確率，降低假陽性率，減少誤診和漏診的發生，在臨床產前篩查中具有重要意義。