孫鑫波，陳從波，陳緒華，黃力

十堰市太和醫院（湖北醫藥學院附屬醫院）1泌尿外科，2皮膚科，湖北 十堰 442000

膀胱癌是泌尿系統惡性腫瘤，傳統的治療手段如手術、化療等雖有一定療效，但復發率和轉移率仍較高，近年來靶向治療成為一個新的治療方向。微小RNA（microRNA，miRNA）是內源非編碼小RNA，在轉錄后水平調控基因表達，研究發現部分異常表達的miRNA與膀胱癌的發生發展密切相關。有報道顯示，miRNA-218-5p通過負調控高遷移率族蛋白 B1（high mobility group box 1，HMGB1）抑制結直腸癌細胞的增殖；下調miRNA-218-5p可通過調節HMGB1促進人臍靜脈內皮細胞凋亡。有研究發現，miRNA-218-5p在膀胱癌組織中低表達，但其對膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響及分子機制尚不清楚。98序列相似的家族成員A（family with sequence similarity 98，member A，FAM98A）基因定位于人類染色體的2p22.3，研究發現其與多種腫瘤的發生發展過程相關，如FAM98A在子宮內膜癌中過表達，與其預后不良有關，FAM98A缺乏可顯著抑制子宮內膜癌細胞活力，促進細胞凋亡。下調FAM98A可促進乳腺癌細胞增殖能力而抑制細胞遷移、侵襲和上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號轉導通路是細胞內重要的信號轉導通路之一，可調節腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等，在腫瘤進展中起重要作用。有研究報道，抑制PI3K/AKT信號通路可提高紫杉醇對膀胱癌T24細胞的殺傷作用，提高化療效果。姜黃素通過增加同源性磷酸酶張力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的表達，抑制PI3K/AKT信號通路的激活而誘導人膀胱癌EJ細胞凋亡。本實驗旨在研究miRNA-218-5p是否通過FAM98A及PI3K/AKT信號通路影響膀胱癌細胞的增殖和凋亡，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常膀胱組織細胞SV-HUC-1和膀胱癌細胞BIU-78、T24、EJ均購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清、RPMI1640培養基、胰蛋白酶、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒均購自美國Sigma公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自日本TaKaRa公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；MTT試劑盒、膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。Thermo FC酶標儀購自美國Thermo公司；FACSCantoⅡ流式細胞儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人正常膀胱組織細胞SV-HUC-1和膀胱癌細胞BIU-78、T24、EJ分別用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基于37℃、5% CO飽和濕度條件下培養，每天換液1次，待細胞融合至80%左右時，加入胰蛋白酶進行消化傳代，選取處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉染與分組 取對數生長期的BIU-78細胞用無血清培養基同步化12 h，隨后進行轉染，將miRNA-con、miRNA-218-5p、si-con、si-FAM98A、anti-miRNA-con和anti-miRNA-218-5p分別轉染至細胞BIU-78中，分別記為miRNA-con組、miRNA-218-5p組、si-con組、si-FAM98A組、anti-miRNA-con組和anti-miRNA-218-5p組，未進行任何處理的BIU-78細胞作為空白對照組（NC）；將miRNA-218-5p分別與pcDNA-con和pcDNA-FAM98A共同轉染至細胞BIU-78中，分別記為miRNA-218-5p+pcDNA-con組和miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組，轉染均按照Lipofectamine2000試劑盒進行操作。

1.2.3 定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測miRNA-218-5p和FAM98AmRNA表達水平 收集以上各組細胞，提取總RNA，反轉錄成cDNA，按照TaKaRa熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系，以β-actin為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次，循環條件為95℃3 min；95℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環；72 ℃延伸5 min。相對表達量采用2法計算。

1.2.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測蛋白表達 收集以上各組細胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，10 340 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDSPAGE電泳后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗（1∶1000），4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗（1∶2000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白相對表達量。實驗重復3次，取均值。

1.2.5 MTT 法檢測細胞增殖率 在以上各組細胞培養至48 h時加入20 μl的MTT溶液，繼續孵育4 h；棄去多余培養基并加入150 μl DMSO振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm處光密度（optical density，OD）值。細胞增殖率（%）=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化各組細胞后離心收集，PBS漂洗2次，加結合緩沖液重懸細胞。依據試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育15 min。流式細胞儀檢測波長488 nm和530 nm處的熒光強度。實驗重復3次，取均值。

1.2.7 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miRNA-218-5p對FAM98A 的靶向調控 TargetScan數據庫預測顯示

FAM98A

3'UTR區域有miRNA-218-5p結合位點。構建含有miRNA-218-5p結合位點的

FAM98A

-3'UTR野生型及突變型報告基因載體，在BIU-78細胞中轉染miRNA-218-5p和野生型、突變型報告基因載體。依據說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統計學分析。實驗重復3次，取均值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 膀胱癌細胞和人正常膀胱組織細胞系中miRNA-218-5p和FAM98A 表達情況的比較

與人正常膀胱組織細胞SV-HUC-1相比，膀胱癌細胞BIU-78、T24、EJ中miRNA-218-5p表達水平均降低，

FAM98A

mRNA和蛋白表達水平均升高，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）（圖1、表1）。因miRNA-218-5p和FAM98A表達在BIU-78細胞中與正常細胞差異最明顯，故后續實驗均采用BIU-78細胞。

表1 膀胱癌細胞和人正常膀胱組織細胞系中miRNA-218-5p、FAM98A表達情況的比較（±s）

圖1 Western blot 檢測膀胱癌細胞和人正常膀胱組織細胞系中FAM98A 蛋白的表達情況

2.2 過表達miRNA-218-5p對BIU-78膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響

與miRNA-con組相比，miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細胞中cyclin D1、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）表達水平均降低，miRNA-218-5p、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，BAX）表達水平均升高，細胞增殖率降低，細胞凋亡率升高，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（圖2、圖3、表2）

表2 NC組、miRNA-con組、miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細胞中各蛋白及細胞增殖、凋亡情況的比較（±s）

圖2 流式細胞儀檢測NC組、miRNA-con組、miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細胞凋亡情況

圖3 Western blot檢測NC組、miRNA-con組、miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細胞cyclin D1、BAX和Bcl-2蛋白表達情況

2.3 敲減FAM98A對BIU-78膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響

與si-con組相比，si-FAM98A組BIU-78膀胱癌細胞中BAX表達水平升高，FAM98A、cyclinD1、Bcl-2表達水平均降低，細胞增殖率降低，細胞凋亡率升高，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（圖4、表3）

表3 NC組、si-con組、si-FAM98A組BIU-78膀胱癌細胞中各蛋白及細胞增殖、凋亡情況的比較（±s）

圖4 Westernblot檢測NC組、si-con組、si-FAM98A組BIU-78膀胱癌細胞cyclin D1、BAX和Bcl-2蛋白表達情況

2.4 miRNA-218-5p靶向FAM98A

通過TargetScan數據庫預測到FAM98A與miRNA-218-5p存在結合位點。熒光素酶報告基因檢測實驗結果顯示，miRNA-218-5p分別與

FAM98A

野生型及突變型報告基因載體共轉染后，野生型BIU-78細胞的熒光素酶活性明顯降低（

P

＜0.01）；而突變型BIU-78細胞的熒光素酶活性變化不顯著（

P

＞0.05）（表4）。Western blot檢測結果顯示，相較于miRNA-con組，miRNA-218-5p組BIU-78細胞中FAM98A表達水平降低（

P

＜0.05）；相較于antimiRNA-con組，anti-miRNA-218-5p組BIU-78細胞中FAM98A表達水平升高（

P

＜0.05）（圖5、表5）。

表4 miRNA-con或miRNA-218-5p與報告質粒共轉染BIU-78細胞后熒光素酶活性的比較（±s）

表5 miRNA-con組、miRNA-218-5p組、anti-miRNA-con組、anti-miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細胞中FAM98A蛋白表達情況的比較（±s）

圖5 Western blot檢測miRNA-con組、miRNA-218-5p組、anti-miRNA-con組、anti-miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細胞中FAM98A 蛋白表達情況

2.5 過表達FAM98A對BIU-78膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響

與miRNA-con組相比，miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細胞中BAX表達水平升高，FAM98A、cyclin D1、Bcl-2表達水平均降低，細胞增殖率降低，細胞凋亡率升高，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）；與miRNA-218-5p+pcDNA-con組相比，miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組BIU-78膀胱癌細胞中BAX表達水平降低，FAM98A、cyclin D1、Bcl-2表達水平均升高，細胞增殖率升高，細胞凋亡率降低，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（圖6、表6）

表6 miRNA-con組、miRNA-218-5p組、miRNA-218-5p+pcDNA-con組、miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組BIU-78膀胱癌細胞中各蛋白及細胞增殖、凋亡情況的比較（±s）

圖6 Western blot檢測miRNA-con組、miRNA-218-5p組、miRNA-218-5p+pcDNA-con組、miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組BIU-78膀胱癌細胞中FAM98A、cyclin D1、BAX和Bcl-2蛋白表達情況

2.6 PI3K/AKT信號通路蛋白表達情況的比較

與miRNA-con組相比，miRNA-218-5p組BIU-78膀胱癌細胞中p-PI3Kp85、p-AKT表達水平均降低（

P

＜0.05）；與miRNA-218-5p+pcDNA-con組相比，miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組BIU-78膀胱癌細胞中p-PI3Kp85、p-AKT表達水平均升高（

P

＜0.05）。（圖7、表7）

表7 miRNA-con組、miRNA-218-5p組、miRNA-218-5p+pcDNA-con組、miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組BIU-78膀胱癌細胞中p-PI3Kp85和p-AKT表達情況的比較（±s）

圖7 Western blot檢測miRNA-con組、miRNA-218-5p組、miRNA-218-5p+pcDNA-con組、miRNA-218-5p+pcDNA-FAM98A組BIU-78膀胱癌細胞中p-PI3Kp85和p-AKT 蛋白表達情況

3 討論

膀胱癌的發病率和病死率呈逐年增長趨勢，嚴重威脅著人們的健康。研究發現miRNA可充當抑癌基因或促癌基因參與膀胱癌細胞的增殖、遷移、凋亡和藥物敏感性等。在非小細胞肺癌中miRNA-218-5p低表達，通過表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。miRNA-218-5p還通過PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號通路靶向EGFR抑制翼狀胬肉上皮細胞的增殖和遷移。此外，拮抗miRNA-218-5p可減弱WNT信號轉導并減少三陰性乳腺癌的轉移性骨病。本實驗結果顯示，miRNA-218-5p在膀胱癌細胞中低表達，過表達miRNA-218-5p可抑制BIU-78膀胱癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，同時促進BAX表達，抑制cyclin D1、Bcl-2表達。

有報道顯示，FAM98A是腫瘤細胞遷移、侵襲和集落形成所需的蛋白精氨酸甲基轉移酶1（protein arginine methyltransferase 1，PRMT1）的新型底物。敲除

FAM98A

可抑制結直腸癌的進展。在非小細胞肺癌中FAM98A高表達，FAM98A通過p38-ATF2信號轉導途徑促進非小細胞肺癌細胞的增殖。本實驗結果顯示，FAM98A在膀胱癌細胞中高表達，敲減

FAM98A

可抑制膀胱癌細胞BIU-78增殖，誘導細胞凋亡，同時促進BAX表達，抑制cyclin D1、Bcl-2表達。此外，miRNA-218-5p靶向負調控FAM98A的表達，過表達FAM98A能逆轉miRNA-218-5p對膀胱癌細胞BIU-78的增殖抑制和凋亡促進作用。PI3K/AKT信號通路是參與細胞增殖調控的重要通路之一，既有抗凋亡作用又有促凋亡作用，以抗細胞凋亡為主。鈣黏蛋白13（cadherin 13，CDH13）下調表達通過激活PI3K/AKT通路促進膀胱癌細胞增殖和克隆形成。抑制miRNA-130b-3p通過上調PTEN表達，抑制PI3K-AKT及整合素β1/黏附斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）信號通路的激活，誘導凋亡，抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。本實驗中，過表達miRNA-218-5p抑制PI3K/AKT信號通路中p-PI3Kp85和p-AKT蛋白的表達，而過表達

FAM98A

能逆轉miRNA-218-5p對p-PI3Kp85和p-AKT表達的抑制作用，說明miRNA-218-5p可能通過調控

FAM98A

進而影響PI3K/AKT信號通路。

綜上所述，miRNA-218-5p可抑制膀胱癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，其機制可能與FAM98A及PI3K/AKT信號通路有關，將可為膀胱癌的預防和治療提供新靶點。