基于網絡藥理學研究黑豆方主要藥物治療濕疹的作用機制

曲 堯 范 玉 劉綠野 王鈺菁 張 潔 耿立東

1.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，山東濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬醫院皮膚科，山東濟南 250014；3.山東中醫藥大學中醫學院，山東濟南 250014

濕疹是由多種內外因素引起的一種具有明顯滲出傾向的臨床常見的皮膚炎癥性疾病，病因目前尚不明確，具有皮疹多型、多對稱發生、自覺奇癢、病程纏綿反復的特點，嚴重影響患者的生活質量。在中醫學中濕疹屬于濕瘡范疇，以清熱利濕止癢為主要治法[1]。黑豆方為山東中醫藥大學附屬醫院皮膚科臨床協定方，在臨床治療中取得了較好效果。本研究選用黑豆方中的6味主要藥物：黑豆、馬齒莧、地骨皮、黃柏、白鮮皮、白及，基于網絡藥理學的相關方法，發掘新的疾病相關的潛在治療靶點，并探索其分子作用機制。

1 資料與方法

1.1 數據庫及軟件

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，Version2.3）[2-3]，藥物靶標數據庫（DrugBank，Version5.1.5）；GeneCards（Version 4.13），在線人類孟德爾遺傳綜合數據庫（OMIM）；蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡平臺STRING（Version 11.0）；UniProt蛋白質數據庫[4]；京都基因和基因組數據庫（KEGG，Release 93.0）[5]；R軟件（Version 3.6.2）；Cytoscape（Version 3.7.2）。

1.2 獲取藥物成分的篩選及靶點

通過TCMSP數據庫搜索6味中藥的中文名稱，對口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）設定數值（OB≥30%，DL≥0.18）作為篩選條件[6]。獲得藥物的化學成分并通過DrugBank數據庫獲得各成分信息。

1.3 獲取濕疹相關基因及靶點信息

在GeneCards數據庫中檢索“eczema”，在OMIM數據庫中檢索“weeping dermatitis”，獲得濕疹相關基因。在UniProt蛋白質數據庫中檢索“Homo sapiens”獲得人類蛋白質-基因表達信息。

1.4 篩選交集基因

參照UniProt蛋白質數據庫獲得的人類蛋白質-基因表達信息，處理數據，得到藥物-成分-靶點-基因之間的對應關系，并通過R繪制韋恩圖[7]，獲得藥物與濕疹的交集基因。

1.5 構建藥物-成分-靶點-基因網絡

將“1.4”中得到的文件導入Cytoscape，構建多維網絡[8]，對所得網絡進行分析。

1.6 PPI網絡構建與分析

將“1.4”中得到的交集基因輸入STRING平臺，得到PPI網絡圖，進行網絡分析。

1.7 基因本體（GO）功能和KEGG通路富集分析

使用R軟件對交集基因進行GO功能[9]和KEGG通路富集分析，獲得數據，繪制統計圖表，在KEGG數據庫中檢索，獲得通路信息及通路圖。

2 結果

2.1 藥物成分及其信息、對應靶點、基因、來源

6味藥物篩選得到100個藥物成分，非重復成分89種[9-15]。潛在靶點基因121個。部分數據見表1～2。

表1 藥物成分及信息

2.2 疾病數據

由GeneCards和OMIM數據庫得到濕疹相關基因2738個。

表2 藥物成分對應靶點、基因、來源

2.3 交集基因與韋恩圖

獲得交集基因共47個（占藥物成分對應基因總數的38.84%，占疾病相關基因總數的1.72%），并繪制韋恩圖。見圖1。

2.4 構建藥物-成分-靶點-基因網絡

處理交集基因和藥物成分相關數據，獲得藥物-成分-基因-疾病的多維網絡關系，部分節點數據見表3，網絡關系見圖2。網絡分析結果顯示白鮮皮、黃柏、馬齒莧中的共有成分槲皮素（quercetin）[16-17]是藥物成分中對濕疹治療靶點對應最多（槲皮素對應節點為38個，其中35個為疾病治療靶點）的成分。

2.5 PPI網絡構建與分析

將47個交集基因導入STRING平臺，按置信度=0.400為標準生成圖像，見圖3，得到47個節點，326條連線，節點平均連線數為13.900，局部平均聚集系數為0.649，PPI網絡富集P值小于1.0e-16。使用R軟件對所得數據進行處理，得到PPI網絡圖中與交集基因有互作的基因數目，見圖4。

圖1 疾病與藥物交集基因韋恩圖

表3 部分節點信息

2.6 GO功能富集和KEGG通路富集分析

2.6.1 GO功能富集分析 共得到876個GO條目，部分數據見表4。按照P值由小到大生成條形圖和氣泡圖，見圖5～6。

2.6.2 KEGG通路富集分析 得到82條相關通路，部分通路數據見表5，按照P值由小到大生成條形圖和氣泡圖，見圖7～8。KEGG通路富集分析結果顯示黑豆等6味中藥的主要成分在治療濕疹的過程中可能涉及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路（圖9）、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、腫瘤中的MicroRNA通路。

圖2 藥物-疾病-成分-基因四維網絡圖

圖3 蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

圖4 蛋白質-蛋白質相互作用基因數目條形圖

圖5 基因本體功能富集分析條形圖

圖6 基因本體功能富集分析氣泡圖

圖7 京都基因與基因組百科全書通路富集分析條形圖

圖8 京都基因與基因組百科全書通路富集分析氣泡圖

3 討論

本研究結果顯示黃柏、白鮮皮、馬齒莧中均存在的槲皮素及黑豆中的豆甾醇（stigmasterol）可能是對濕疹發揮治療作用的重要成分[18]。其中槲皮素對應的靶點基因達到35個，對應基因多數位于按P值排序后排序較為靠前的通路中。查閱文獻發現槲皮素與KEGG通路富集分析中P值最小的TNF信號通路在其他疾病中存在關聯[19]。研究顯示，槲皮素能改善脂多糖誘導的人肝細胞炎癥損傷，減少白細胞介素（interleukin，IL）-1β、TNF-α 等炎癥因子釋放[20]。槲皮素同時也是魚腥草的抗菌活性成分[21]。此外，有報道，槲皮素對胃癌、肝癌、鼻咽癌等有抗腫瘤活性[22-23]。

表4 GO功能富集分析結果

表5 KEGG通路富集分析結果

圖9 腫瘤壞死因子信號通路圖

結合PPI網絡分析與KEGG通路富集分析所得數據，黑豆方中主要藥物成分作用靶點涉及IL-6和胱天蛋白酶3調控的TNF信號通路。其中IL-6作為介導炎癥反應因子的編碼基因，在濕疹發病過程中可能起到重要作用[24-25]。彭艷梅[26]在治療表皮生長因子抑制劑相關皮膚不良反應的臨床和實驗研究中發現，炎癥性致癢皮膚病小鼠組織中白三烯B4、TNF-α、IL-1β的釋放增加，且血清中的含量高于皮膚組織，并發現使用止癢平膚液（主要藥物為黃芩、苦參、白鮮皮、馬齒莧4味）能減少皮膚組織和血清中TNF-α、IL-1β的釋放，該研究提示中藥復方可通過調整炎癥機制，發揮抗感染作用治療濕疹。

本研究通過網絡藥理學的相關方法對多個數據庫所得數據進行的一系列數據處理、分析[27]。從PPI、GO功能富集、KEGG通路富集三個方面，探尋黑豆方治療濕疹的潛在靶點蛋白與信號通路，為后續進行相關的動物試驗驗證提供研究思路和方向，為進一步探究中藥復方治療濕疹的機制提供參考。