發酵類中藥飲片淡豆豉和六神曲微生物污染情況及耐熱菌考察

石 柳 丁純潔 陳麗艷 孫銀玲 曹 陽 鄭宏宇 王偉明

黑龍江省中醫藥科學院中藥研究所，黑龍江哈爾濱 150036

近年來，中藥飲片微生物污染問題引起廣泛關注，而發酵類中藥飲片比普通中藥飲片存在更高安全風險。發酵類中藥飲片是指采用發酵法炮制，因復雜生物轉化而起到改變藥性、增強藥效、降低毒性等作用的中藥飲片[1-2]。其中參與發酵的微生物受環境等多種因素影響種群變化較大，使其質量不可控、易污染內外源有害微生物[3]。此外，部分發酵類中藥飲片也存在可調整腸道菌群的有益發酵菌[4-6]，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等[7-8]，不應作為污染菌加以限制。目前對發酵類中藥飲片微生物限度標準未見特殊規定[9-10]，相關系統研究也鮮有報道。

淡豆豉（Sojae Semen Praeparatum）和六神曲（Massa Medicata Fermentata）在臨床及成方制劑中最為常用，分別收載于《中華人民共和國藥典》[11]及部頒標準[12]中。因此本研究選擇不同產地和批次的淡豆豉和六神曲，對其需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌及耐熱菌進行考察，鑒定耐熱菌，為發酵類中藥飲片微生物限度標準的制訂提供更完整的依據。

1 材料與方法

1.1 供試品

10批次淡豆豉飲片產地分別為：山東（D1-1）、云南（D2-1）、廣東（D3-1）、北京（D4-1）、北京（D4-2）、河北（D5-1）、河北（D5-2）、安徽（D6-1）、安徽（D6-2）、安徽（D6-3）；5批次六神曲飲片產地分別為：四川（L7-1）、福建（L8-1）、河北（L9-1）、安徽（L10-1）、安徽（L10-2）。所有飲片均購自哈爾濱市各藥店。

1.2 標準菌株

金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC（B）98001和黑曲霉CMCC（F）98003購自中國醫學細菌保藏管理中心；枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501、銅綠假單胞菌CMCC（B）10104和乙型副傷寒沙門菌CMCC（B）50094購自北京北納創聯生物技術研究院。

1.3 儀器

DHP9272恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；DL-CJ-2N超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；BSA224S賽多利斯電子天平（0.0001 g）（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（哈爾濱華儀行經貿有限公司）；Biolog微生物自動分析儀（美國Biolog公司）；MF3迅數菌落分析儀（杭州迅數科技有限公司）。

1.4 培養基及主要試劑

沙氏葡萄糖瓊脂培養基HB0253-81、胰酪大豆胨瓊脂培養基HB0177-1、麥康凱液體培養基HB8313-5、麥康凱瓊脂培養基HB6238-10、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基HB0116-4、腸道菌增菌液體培養基HBKP0 126-4、RV沙門菌增菌液體培養基HB4198-11、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基HB4105-6、三糖鐵瓊脂培養基HB4088-62、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基HBKP5184-31、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基HB41 28-22、念珠菌顯色培養基HB7015均購自青島海博生物技術有限公司；Biolog-Gen ⅢMicroplate購自美國Biolog公司；1%二鹽酸N，N-二甲基對苯二胺試液（批號：20191014）和吐溫80（批號：301C054）均為國產分析純。

1.5 供試液制備

取供試品25 g加入225 mL pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，充分振搖蕩洗制成1∶10供試液。

1.6 方法適用性實驗

方法適用性實驗參考2015年版 《中華人民共和國藥典》四部微生物限度檢查法通則1105和1106[13]。

1.6.1 傾注法計數方法適用性試驗 試驗組取適當稀釋的供試液10 mL與0.1 mL菌液混勻，取混合液1 mL于無菌平皿中，注入培養基，平行制備2個平皿。用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代菌液為供試品對照組，替代供試液為菌液對照組。需氧菌30～35℃培養3 d，霉菌和酵母菌20～25℃培養5 d。

1.6.2 控制菌方法適用性試驗 分別取供試液10 mL，接種至100 mL每一控制菌對應液體培養基中，再加入相應菌液1 mL，33℃培養18 h。取上述培養物劃線接種于對應培養基平板，33℃培養18 h。

1.7 需氧菌、霉菌和酵母菌考察

參照“1.6.1”項下，取適當稀釋倍數的3個連續稀釋級供試液1 mL于無菌平皿中，分別加入胰大豆胨瓊脂培養基和沙氏葡萄糖瓊脂培養基平行制備2個平皿，分別以最接近且小于300 cfu和100 cfu菌落數的胰大豆胨瓊脂培養基和沙氏葡萄糖瓊脂培養基平皿計數。

1.8 控制菌污染情況考察

參照“1.6.2”項下，檢測淡豆豉和六神曲飲片中金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌、銅綠假單胞菌、乙型副傷寒沙門菌和白色念珠菌。

1.9 耐熱菌考察

取供試品10 g加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨溶液至100 mL，煎煮30 min，參照“1.6.1”項下，測定耐熱菌菌落總數并分離、純化優勢耐熱菌株，加入GenⅢ板孵育后通過顯色孔產生的“表型指紋”同Biolog數據庫比較，在種的水平上鑒定微生物。

2 結果

2.1 需氧菌、霉菌和酵母菌方法適用性試驗結果

傾注法計數及控制菌檢查方法均符合《中華人民共和國藥典》[13]規定。見表1～2。

表1 需氧菌、霉菌和酵母菌方法適用性試驗結果（x，cfu/平皿，n=2）

表2 控制菌方法適用性試驗結果（n=2）

2.2 需氧菌、霉菌和酵母菌微生物計數結果

市售淡豆豉飲片各批次需氧菌介于104～108cfu/g，霉菌和酵母菌介于103～108cfu/g；六神曲飲片各批次需氧菌、霉菌和酵母均介于103～105cfu/g。見表3。

表3 淡豆豉飲片需氧菌、霉菌和酵母菌微生物計數結果（cfu/g）

表4 六神曲飲片需氧菌、霉菌和酵母菌微生物計數結果（cfu/g）

2.3 控制菌檢查結果

10批次淡豆豉飲片均檢出控制菌，其中全部批次檢出金黃色葡萄球菌，8批次檢出大腸埃希菌，4批次檢出耐膽鹽革蘭陰性菌數量＞103cfu/g，6批次檢出銅綠假單胞菌，乙型副傷寒沙門菌和白色念珠菌均未檢出。

5批次六神曲飲片中有4批次檢出控制菌，其中2批次檢出金黃色葡萄球菌，4批次檢出大腸埃希菌，1批檢出次耐膽鹽革蘭陰性菌數量＞103cfu/g，銅綠假單胞菌、乙型副傷寒沙門菌和白色念珠菌均未檢出；L9-1均未檢出上述控制菌。

2.4 耐熱菌檢查結果

淡豆豉和六神曲飲片經加熱煮沸后需氧菌總數分別平均降低1.5和3.2個對數單位。淡豆豉飲片耐熱菌數量介于103～108cfu/g，＞105cfu/g的樣品比例達80%。其中D2-1耐熱菌總數水平最低，D3-1最高。六神曲飲片L8-1和L10-2未檢測出耐熱菌，其余3批次含量介于10～102cfu/g，L9-1耐熱菌總數水平最高。共分離出8株優勢耐熱菌株，均為芽孢桿菌，其中6株為枯草芽孢桿菌及亞種，1株地衣芽孢桿菌，1株索諾拉沙漠芽孢桿菌。

3 討論

發酵炮制的中藥飲片不僅易受原輔料及環境中有害微生物污染[14-16]，還需確保一定數量有益發酵菌促進發酵基質活性成分的生物轉化[17-18]。而《中華人民共和國藥典》[13]2015年版僅對“研粉口服用貴細飲片、直接口服及泡服飲片”的部分控制菌進行檢查，以國外標準判斷飲片質量會存在一定比例不合格率[19-20]，阻礙中藥國際化進程。

本研究顯示淡豆豉飲片需氧菌、霉菌和酵母菌的數量最高可達108cfu/g，如用于中成藥中很難達到藥典標準，此外，不同批次的淡豆豉飲片控制菌污染嚴重，提示無論直接口服或做成含原粉制劑都存在一定安全隱患。以枯草芽孢桿菌為主的耐熱菌具有豐富營養成分及廣泛藥理活性[21-22]，提示發酵類中藥飲片可采用無菌可控溫條件下純菌種發酵制備以保證用藥安全和質量穩定。目前淡豆豉、六神曲等發酵類中藥飲片的純種發酵工藝研究已有報道[23-25]，對其質量標準提升提供了依據，但尚需系統研究。

綜上所述，應在純種發酵前提下根據不同發酵類中藥飲片品種，針對性建立微生物限度指標，從控制污染和確保藥效兩個角度發揮發酵類中藥的特殊優勢。