金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒HPLC特征圖譜相關性研究

郭 晨 李 夕 郭珮怡 楊建剛 楊海燕 曹愛蘭 張 俏

1.陜西醫藥控股醫藥研究院有限公司藥物質量研究部，陜西西安 710000；2.陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西西安 710000；3.陜西中藥研究所 陜西醫藥信息中心，陜西咸陽 712000

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒，疏散風熱的功效[1-2]。金銀花作為傳統中藥材，含有黃酮類、有機酸類、環烯醚萜苷類、三萜皂苷類、揮發油類、無機元素類、有機元素類等[3-5]多種化學成分，在解熱、抗炎[6-9]、抗菌[10-13]、抗病毒[14-15]等方面均發揮較顯著療效，同時在抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、降低血糖、保肝、保護肺臟、保護神經、治療婦科疾病等方面亦表現出一定的作用[16]。由于該藥化學成分種類較多、極性強、含量差異大，采用傳統方法研究金銀花中的有效成分難度較大、耗時較長，因此，找到快速、高效地方法對金銀花中的化學成分進行分析、檢測、辨別，對提升其質量標準具有重要意義[17]。

金銀花配方顆粒是以金銀花藥材為原料，經過提取、濃縮、干燥、制粒等工藝制備而成，失去了金銀花藥材的外觀特征，難以直接鑒別，且很難用某一成分作為質量控制指標來全面衡量配方顆粒的品質，需要制訂專屬性、重復性更強且更加有效的方法來控制金銀花藥材配方顆粒的質量。特征圖譜的研究能很好地為金銀花配方顆粒在化學成分層面上的定性鑒別提供依據。為保證金銀花配方顆粒安全、有效、質量可控，本研究采用HPLC法建立金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒的特征圖譜，并比較四者主要化學成分的差異。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Thermo Scientific U3000紫外檢測器、二極管陣列檢測器）；電子分析天平（Ag135、Ag285、PB3002-S，梅特勒）；超聲波清洗器（KQ5200型，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，S41A1，HoneyWell）；甲醇（分析純，2018072501，成都市科隆化學品有限公司）；磷酸（分析純，2014102401，成都市科龍化工試劑廠）；水為超純水。

綠原酸對照品（CAS號：327-97-9，批號：110753-201817，純度：96.8%，中國食品藥品檢定研究院）；新綠原酸對照品（CAS號：906-33-2，批號：1025257186，純度：≥98.0%，SIGMA）；隱綠原酸對照品（CAS號：905-99-7，批號：P30A9L69104，純度：≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司）；異綠原酸A（3，5-O-二咖啡酰奎寧酸）對照品（CAS號：2450-53-5，批號：Y24N8Y49 009，純度：≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司）；異綠原酸B（3，4-O-二咖啡酰奎寧酸）對照品（CAS號：14534-61-3，批號：P20J9F53191，純度：≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司）；異綠原酸C（4，5-O-二咖啡酰奎寧酸）對照品（CAS號：32451-88-0，批號：P25J9L 66496，純度：≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司）。

15批金銀花藥材（編號、產地依次為：S1-河南、S2-山東、S3-山東、S4-山東、S5-山東、S6-山東、S7-陜西柞水下梁鎮、S8-陜西山陽縣戶坦鎮、S9-陜西鎮安縣采糧鎮、S10-山東、S11-山東、S12-山東、S13-湖北、S14-湖北、S15-湖北）；15批金銀花標準湯劑（編號依次為：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15，來源：自制）；15批金銀花中間體（編號依次為：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15，來源：自制）；15批金銀花配方顆粒（編號依次為：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15，來源：自制）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Scientific AcclaimTM120 C18（5 μm，4.6×250 mm）；流動相：乙腈為流動相A，0.4%磷酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫程序見表1；檢測波長：327 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；理論板數按綠原酸峰計算應不低于2000[1]。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對照品及供試品溶液的制備

2.2.1 參照物溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為40 μg/mL的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度分別為40 μg/mL的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.3 金銀花藥材供試品溶液的制備 取金銀花藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 金銀花標準湯劑的制備 取金銀花藥材100.0 g，加水量一般以浸過藥材平面2～5 cm為宜，浸泡30 min，提取兩次，每次15 min，過濾，合并兩次的提取液，減壓濃縮，即得標準湯劑供試品。

2.2.5 金銀花標準湯劑供試品溶液的制備 取標準湯劑供試品適量，制備方法同“2.2.3”項下。

2.2.6 金銀花中間體的制備 取金銀花藥材2000.0 g，加12倍量水，浸泡30 min，提取兩次，每次30 min，過濾，合并兩次的提取液，濾液濃縮至相對密度為1.05～1.15（60℃），噴霧干燥，即得中間體供試品。

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2.2.7 金銀花中間體供試品溶液的制備 取中間體供試品適量，制備方法同“2.2.3”項下。

2.2.8 金銀花配方顆粒的制備 取金銀花藥材2000.0 g，加12倍量水，浸泡30 min，提取兩次，每次30 min，過濾，合并兩次的提取液，濾液濃縮至相對密度為1.05～1.15（60℃），噴霧干燥，加入糊精制粒，即得配方顆粒供試品。

2.2.9 金銀花配方顆粒供試品溶液的制備 取配方顆粒供試品適量，制備方法同“2.2.3”項下。

2.3 方法學考察

借鑒2015年版《中華人民共和國藥典》一部[1]中金銀花提取物質量標準，通過流動相的比較、檢測波長的選擇、檢測時長的確定、提取溶劑的選擇等條件選擇實驗，最終確定選取金銀花中6個綠原酸類成分為目標成分。通過實驗建立了以綠原酸為參照物，同時評定金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒中新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C[18-23]的特征圖譜分析方法。

2.3.1 精密度試驗 按照“2.2”項下方法制備金銀花4個品種供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別連續進樣6次，每次10 μL，結果6個共有峰保留時間RSD小于0.06%、0.07%、0.07%、0.07%，峰面積RSD小于0.28%、0.16%、0.12%、0.15%，說明該方法精密度良好，符合特征圖譜的要求。

2.3.2 穩定性試驗 按照“2.2”項下方法制備金銀花4個品種供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別于0、4、8、12、16、20、24 h進樣，每次10 μL[5]，結果6個共有峰保留時間RSD小于0.18%、0.19%、0.17%、0.17%，峰面積RSD小于0.60%、0.28%、0.22%、1.50%，說明24 h穩定性良好，符合特征圖譜的要求。

2.3.3 重復性試驗 按照“2.2”項下方法分別制備金銀花4個品種供試品溶液各6份，按照“2.1”項下色譜條件分別進樣，每次10 μL，結果6個共有峰保留時間RSD小于0.04%、0.04%、0.09%、0.04%，說明該方法重復性良好，符合特征圖譜的要求。

2.3.4 耐用性試驗 按照“2.2”項下方法制備金銀花4個品種供試品溶液，分別調整流速（0.8、1.2 mL/min），調整柱溫（25、35℃），調整流動相中乙腈、水相的比例（乙腈比例增加2.5%、水相比例增加2.5%）分別進樣檢測，并與“2.1”項下原色譜條件進樣檢測結果進行比較。供試品色譜中均呈現6個特征峰，與綠原酸參照圖譜進行比對，與綠原酸峰保留時間一致的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間[24]，除水相比例增加2.5%和調整流速為0.8 mL/min條件下的相對保留時間在規定值的±8%之內，其余均在規定值的±5%之內，規定值為：0.76（峰1）、1.00（峰2）、1.05（峰3）、1.80（峰4）、1.87（峰5）、2.01（峰6）[1]，所以該方法耐用性基本良好。

2.4 特征圖譜的建立

2.4.1 金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒特征峰的確定 按照“2.2”項下方法分別制得混合對照品溶液和金銀花4個品種供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，進行全波長掃描。通過比對各色譜峰保留時間和紫外吸收圖譜，指認其中6個色譜峰[25]，分別為：峰1-新綠原酸，峰2-綠原酸，峰3-隱綠原酸，峰4-異綠原酸B，峰5-異綠原酸A，峰6-異綠原酸C，見圖1。選擇6個共有峰中保留時間適中，且為檢測指標成分的綠原酸峰作為S峰。

2.4.2 金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒特征圖譜的建立按照“2.2”項下方法分別制備 15批金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別進樣檢測，將色譜圖導入國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，采用中位數法，對色譜圖進行匹配，分別得到特征圖譜。

圖1 混合對照品圖譜

金銀花藥材中確定了6個共有峰，且15批金銀花藥材相似度均達到0.90以上，說明金銀花藥材各產地間化學成分組成基本一致。見圖2。

圖2 15批金銀花藥材HPLC特征圖譜

金銀花標準湯劑匹配出8個共有峰，但7、16 min左右的兩個小峰一部分批次不易識別，所以并未作為特征峰。15批金銀花標準湯劑相似度均達到0.90以上，說明金銀花標準湯劑質量均一、工藝穩定。見圖3。

圖3 15批金銀花標準湯劑HPLC特征圖譜

金銀花中間體匹配出8個共有峰，但7、16 min左右的兩個小峰一部分批次不易識別，所以并未作為特征峰。15批金銀花中間體相似度均達到0.90以上，說明金銀花中間體質量均一、工藝穩定。見圖4。

金銀花配方顆粒確定了6個共有峰，且15批金銀花配方顆粒相似度均達到0.90以上，說明金銀花配方顆粒質量均一、工藝穩定。見圖5。

圖4 15批金銀花中間體HPLC特征圖譜

圖5 15批金銀花配方顆粒HPLC特征圖譜

本研究采用HPLC法建立了金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒的特征圖譜，方法學考察結果表明此方法準確、可行、重復性良好，可用于金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒的質量控制。

2.4.3 金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒相關性分析 將金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒對照圖譜導入國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2012版）”，采用中位數法，對其匹配并進行相似度計算，匹配圖譜見圖6，相似度結果見表2。

3 討論

本試驗采用HPLC法建立了金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒的特征圖譜，方法學考察中：精密度、穩定性、重復性的RSD均小于3%；耐用性，均符合系統適用性要求，除水相比例增加2.5%和調整流速為0.8 mL/min條件下的相對保留時間在規定值的±8%之內，其余均在規定值的±5%之內，規定值為：0.76（峰1）、1.00（峰2）、1.05（峰3）、1.80（峰4）、1.87（峰5）、2.01（峰6）[1]，通過方法學考察試驗結果可知，該方法適合用于金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒的特征圖譜檢測。

圖6 金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒對照圖譜匹配圖

表2 金銀花藥材、標準湯劑、中間體、配方顆粒對照圖譜相似度評價結果

本研究中，金銀花藥材與標準湯劑、中間體及配方顆粒的對照圖譜的主要峰基本一致，主要化學成分組成基本相同，但是相似度未全達到0.9，僅接近0.8，說明金銀花藥材在提取后，其成分上有一定變化，并且可以看出酚酸類成分的兩組同分異構體在比例上也有明顯的改變，如異綠原酸A（3，5-O-雙咖啡酰奎寧酸）的比例在提取后明顯降低，而新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B（3，4-O-雙咖啡酰奎寧酸）、異綠原酸C（4，5-O-雙咖啡酰奎寧酸）的比例明顯升高；金銀花配方顆粒與標準湯劑的相似度達到了0.97以上，說明配方顆粒與標準湯劑化學成分組成基本一致，兩者具有相同的藥用物質基礎。因此，以金銀花標準湯劑為基準，標化金銀花配方顆粒的質量有助于實現臨床用藥的一致性和安全性。