蒙藥文冠木黃酮類有效成分的提取及含量測定

劉 君 董秋梅

內蒙古醫科大學中醫學院，內蒙古呼和浩特 010110

蒙古族藥文冠木（Xanthoceras sorbifolia Bunge），為無患子科植物文冠果的莖干，蒙語名霞日-森登，有祛風止痛，散濕化瘀之功效，可治療類風濕性關節炎（RA）、痛風等[1-2]。前期研究顯示[3]，蒙藥森登-4可抑制RA模型大鼠滑膜新生血管增生，對膠原誘導性關節炎（CIA）大鼠骨破壞及CIA-FLS體外增殖有明顯抑制作用[4]。文冠木是其有效組成之一，含有豐富的黃酮類化合物。黃酮類化合物由5000多種結構不同的天然化學物質組成[5]，可預防多種疾病，如抗癌、抑菌[6-7]、預防人類骨質流失[8]、抗病毒[9]、抗動脈粥樣硬化[10]，且對糖尿病、風濕等免疫性疾病有療效[11-12]，另文冠果對阿爾茨海默病有抑制作用，可改善記憶障礙[13-14]。近年對于文冠木藥材的分離和提取[15-17]，質量標準有報道[18-20]，但對文冠木主要黃酮類成分槲皮素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的質量控制未見研究。文冠木內含量較高的活性成分有二氫楊梅素、槲皮素、楊梅素、EGCG等[21]，本研究旨在建立槲皮素和EGCG含量測定方法，為其質量控制提供參考，以期為研究單藥的有效成分及藥物的研發提供科學依據。

1 儀器與試藥

槲皮素對照品（批號：20191125，純度：＞99%）、EGCG對照品（批號：20191126，純度：＞99.89%）均購自成都德思特公司；文冠木藥材購自內蒙古國際蒙醫院，經內蒙古醫科大學中藥教研室任長勝教授鑒定為文冠木。色譜級甲醇和乙腈，水為超純水。

液相色譜儀（美國Waters2695型）；BenchTop Pro真空冷凍干燥機（美國）；大孔樹脂（安徽三星樹脂科技有限公司）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；梅特勒-托利多分析天平（精密度：0.0005～0.0100 mg）

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液 5 kg文冠木經蒸餾水浸泡1 h，水煎提取1 h，趁熱過濾藥液。60℃恒溫減壓濃縮。將濃縮后的文冠木提取物置于真空冷凍干燥機低溫升華干燥8 h后，密封置于4℃冰箱儲存備用。用AB-8大孔樹脂分離提純，用水-95%乙醇體系不斷洗脫得到目標段化合物后，再逐步減壓濃縮約200 mg。稱取文冠木提取物0.2 g，加入甲醇50 mL；以150 W、50 kHz超聲30 min，冷卻，稱重，用0.45 μm微孔濾膜過濾后制成供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液 稱取槲皮素對照品4.82 mg，EGCG對照品4.91 mg，用甲醇溶解并定容，得到槲皮素0.241 mg/mL、EGCG 0.246 mg/mL對照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～45 min，95%A；45～46 min，40%A；46～50 min，95%A）；檢測波長：225 nm；流速：1 mL/min；柱溫：28℃；進樣量：20 μL。

取文冠木供試品、槲皮素和EGCG對照品溶液進樣測定，各待測成分的色譜峰與相鄰峰間分離度大于1.5，理論板數均在3000以上。見圖1。

2.3 檢測限與定量限

取槲皮素、EGCG對照品各適量，精密稱定后分別置于量瓶中，用流動相溶解并逐級稀釋至一定溶度，按“2.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以信噪比（S/N=3±1）的濃度為檢測限，信噪比（S/N=10±1）的濃度為定量限。見表1。

2.4 線性范圍考察

分別量取“2.1.2”項下對照品溶液，用甲醇稀釋至槲皮素對照品濃度為0.060、0.121、0.241、0.482、0.964 mg/mL；EGCG對照品濃度為0.062、0.123、0.246，0.492、0.984 mg/mL，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以峰面積Y為縱坐標，對照品濃度X為橫坐標，進行線性回歸分析，繪制標準曲線，求槲皮素、EGCG對照品的回歸方程。見表1。

圖1 對照品及供試品色譜圖

表1 槲皮素和EGCG線性范圍考察及檢測限、定量限

2.5 精密度

取“2.1.1”項下供試品溶液，連續進樣6次，計算槲皮素和EGCE峰面積的RSD值。結果槲皮素和EGCG峰面積的平均RSD分別為1.04%、1.06%。

2.6 重復性

取“2.1.1”項下供試品溶液6份，進樣測定槲皮素、EGCG峰面積的RSD值。結果顯示，槲皮素、EGCG峰面積的平均RSD值均小于1.83%，表明該分析方法具有良好的重復性。

2.7 穩定性

取“2.1.1”項下供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣測定槲皮素、EGCG峰面積的RSD值。結果顯示，不同時間點槲皮素、EGCG峰面積平均RSD值均小于1.83%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.8 加樣回收率

稱取文冠木提取物0.2 g，共6份，分別加入槲皮素和EGCG對照品適量，按“2.1.1”項下方法制備，按“2.2”項下條件進樣分析，在相同色譜條件下，反復進樣6次，計算回收率。見表2。

表2 加樣回收率

2.9 槲皮素和EGCG含量

3個批次文冠木提取物按“2.2.1”項下條件制備，按“2.2”條件進樣測定峰面積，計算槲皮素、EGCG含量。見表3。

表3 槲皮素和EGCG含量

3 討論

文冠木是蒙古族習用藥材，廣泛運用于臨床中，體現在消炎鎮痛、提高免疫力、增強記憶力、活血等方面，但對質量控制研究的方法相對較少。本實驗通過提取文冠木黃酮類有效成分，經多次預實驗，確立水-乙醇梯度洗脫，建立完善質量標準研究[22]，最終確定流動相：乙腈－水，才得到槲皮素和EGCG較好的峰形。HPLC法測定結果顯示文冠木提取工藝穩定可靠，質量控制簡便、可操作性強。

現代藥理表明，槲皮素可能通過下調Bcl2及上調Bax因子的表達，降低Bcl2/Bax比值，誘導腦膠質瘤細胞凋亡[23]，抑制癌細胞增殖和誘導細胞凋亡。槲皮素可通過抑制核因子-κB激活，減少炎性環境中軟骨細胞內基質金屬蛋白酶-13的產生、加快基質降解，促炎細胞凋亡，起到保護軟骨的作用[23]；EGCG有抗氧化、抗腫瘤、保護神經系統、保護心腦血管、抑菌、干預代謝酶等作用[24]，能顯著提高RA患者體內CD19、白細胞介素-10、Breg在淋巴細胞內占比，且與記憶B細胞和漿母細胞總和的比值升高有關[25]。由此，二者均對RA有一定的療效。

文冠木中槲皮素和EGCG含量可觀，為文冠木的臨床研究明確了方向。隨著文冠木化學成分及藥理活性的不斷被發掘被證實，文冠木作為一種具有發展前景的蒙古族藥，還需不斷深入研究，規范用藥指導，使單藥在治療RA中將起到不可估量的作用。