基于網絡藥理學角度探討銀芪軟膏對糖尿病足潰瘍的干預機制

陳潤銘 杜玉青 李友山 董學宇 安 琪 謝存香

北京中醫藥大學東直門醫院周圍血管科，北京 100700

糖尿病足潰瘍是由糖尿病微血管病變導致的局部潰瘍，具有高發和高致殘的特點。截止到2019年，我國糖尿病足潰瘍的年發病率已經達到8.1%，同時，糖尿病足潰瘍是造成非外傷性低位截肢的最主要原因之一[1]。因此控制糖尿病足潰瘍惡化以減少截肢的發生是糖尿病足潰瘍的治療重點。

中醫藥在治療糖尿病足潰瘍上有著豐富的經驗和卓越的效果。銀芪軟膏是由全國名老中醫，我國周圍血管科專家龐鶴教授在總結自己治療糖尿病足潰瘍多年的臨床經驗的基礎上研制而成的外用制劑，在臨床上收效顯著。李友山等[2]實驗中證實了銀芪軟膏有明顯促進糖尿病足潰瘍愈合的作用?！吨嗅t藥發展戰略規劃綱要（2016—2030年）》[3]中指出鼓勵基于經典名方、名醫名方、醫療機構制劑等的中藥新藥研發。銀芪軟膏屬于名醫名方，應該得到開發與應用，這不僅符合國家中醫藥發展戰略地實施，也為糖尿病足潰瘍提供新藥。然而銀芪軟膏的有效成分以及作用機制在現階段尚存疑，這使其質量評價以及進一步開發受到了限制。

銀芪軟膏由金銀花、黃芪、三七組成，具有清熱解毒、化瘀生肌的作用。然而其具體生效機制并不是每味中藥功效的簡單相加，而是諸味藥物協同作用于人體而成的結果。找到中藥作用于機體生命活動的規律是發現中藥作用機制的關鍵。網絡藥理學是一門把系統生物學和藥理學相結合的新學科，它能夠把中藥化學成分、化學成分的作用靶點、疾病靶標以及信號通路聯系起來，構建“中藥-化學成分-靶標-通路”相互作用的網絡關系，通過對網絡的富集分析，從中發現藥物與疾病的關系。這為找到藥物的作用機制和開發新藥提供了新思路[4]。本研究基于網絡藥理學構建了銀芪軟膏與糖尿病足潰瘍的“中藥-化學成分-核心靶標-通路”的網絡，旨在探討銀芪軟膏對糖尿病足潰瘍的干預機制，為銀芪軟膏的質量評價及新藥開發提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 銀芪軟膏與糖尿病足潰瘍“成分-靶標-通路-疾病”的網絡構建

1.1.1 銀芪軟膏化學成分來源 在中醫藥整合藥理學研究平臺2.0（TCMIP v2.0）選擇中藥材數據庫這一模塊，在頁面分別輸入“金銀花”“黃芪”“三七”，即可獲得這3味中藥的化學成分，建立銀芪軟膏的化學成分數據庫。

1.1.2 候選靶標來源及靶標預測 在TCMIP v2.0疾病相關分子數據庫，輸入“Diabetic Foot Ulcer”作為疾病關鍵詞進行檢索，就可以收集到糖尿病足潰瘍的候選疾病靶標。選擇中藥靶標預測及功能分析模塊，輸入“金銀花-黃芪-三七”，選取相似性分數≥0.8的成分預測靶標作為候選。TCMIP v2.0利用Tanimoto系數定義的相似度計量方法，針對中藥化學成分（可根據成藥性等級進行篩選）與食品藥品監督管理局上市藥物進行相似性打分，取相似分數≥0.8的中藥候選靶標。

1.1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）信息 銀芪軟膏的潛在靶標與糖尿病足潰瘍疾病靶標之間的PPI可通過TCMIP v2.0直接獲得，該平臺整合了HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、DIP、PDZBase等多個蛋白質相互作用數據庫。

1.1.4 網絡構建與分析 通過TCMIP v2.0的中醫藥關聯網絡挖掘模塊，針對銀芪軟膏作用的潛在靶標與糖尿病足潰瘍疾病靶標之間的PPI信息計算網絡特征值，以“節點連接度（degree）”的2倍中位數為卡值，選取中藥靶標-疾病基因互作網絡的核心節點（hubs）；在此基礎上，以“degree”“節點緊密度（closeness）”和“節點介度（betweenness）”的中位數為卡值，選取同時滿足3個卡值的節點為銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍的關鍵靶標網絡。通過基因功能和通路的富集分析，進一步挖掘銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍的關鍵靶標及其對應的活性成分，并構建可視化的“中藥-化學成分-核心靶標-通路”多層次網絡關聯圖。

1.2 基因功能和通路富集分析

在TCMIP v2.0平臺選擇中醫藥關聯網絡挖掘模塊，依托Reactome數據庫的Pathway信息，篩選銀芪軟膏關鍵網絡靶標基因顯著參與的分子通路；依托基因本體數據庫（GO）篩選銀芪軟膏關鍵網絡靶標基因顯著參與的生物學反應、所行使的分子功能及其所在細胞內定位；通過KEGG富集分析，針對銀芪軟膏的關鍵潛在靶標，進行基因功能分析和通路分析，并將P值排名靠前的通路展示在結果中。

2 結果

2.1 銀芪軟膏化學成分預測及靶標分析

金銀花總共收集化學成分47個，預測靶標163個，主要為有機酸類、環烯醚萜類、黃酮類等。黃芪總共收集化學成分27個，預測靶標399個，主要由黃酮類、皂苷類、多糖類等組成。三七總共收集化學成分79個，預測靶標246個，其中主要成分為三七總皂苷。其中金銀花與黃芪共有靶標120個，金銀花與三七共有靶標136個，黃芪與三七共有靶標217個。

對銀芪軟膏進行基因分析（表1），可見候選靶標基因功能分析涉及類固醇激素介導的信號通路、離子跨膜運輸、脂質代謝過程等條目。對銀芪軟膏候選靶標進行通路富集分析（表2），可見涉及核受體轉錄途徑、γ-氨基丁酸（GABA）受體激活、二氧化碳的可逆水合作用、白細胞介素-4和白細胞介素-13信號等通路。

2.2 銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍的核心靶標網絡

通過TCMIP v2.0的中醫藥關聯網絡挖掘模塊，構建銀芪軟膏潛在靶標與疾病靶標相互作用網絡，見圖1。根據條件篩選出核心靶標網絡12個節點，節點大小與degree呈正相關，其中核心節點有4個，疾病與藥物聯系最密切的靶標為ABL1。

表1 銀芪軟膏候選靶標基因功能分析

2.3 銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍的GO基因功能及KEGG通路富集分析

圖1 銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍核心靶標網絡

銀芪軟膏的GO基因功能分析結果顯示有共因子代謝過程、一氧化氮合成活性調節、轉錄的正調節，DNA模板化、基因表達的負調節、信號轉導、RNA聚合酶Ⅱ對轉錄的正反調節、DNA模板化的9個條目。見表3。銀芪軟膏的kEGG通路富集分析結果顯示其主要作用通路包括四氫生物蝶呤（BH4）的合成、再循環、回收和調節，一氧化氮合成酶（eNOS）激活，血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）介導的血管通透性3個條目。見表4。

表3 銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍關鍵靶標基因功能分析

表4 銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍關鍵靶標通路富集分析

2.4 銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍的“中藥-成分-靶標-通路”多維網絡

銀芪軟膏的關鍵藥靶一共有4個，靶標大小與相關度呈正相關。見圖2。圖中最大的靶標為HSP90AA1。該網絡還與53個化學成分相關聯，其中黃芪4個，分別為β-谷甾醇、華良姜素、黃芪皂苷Ⅶ、4-二甲氧基異黃烷-7-O-β-D-葡萄糖苷。金銀花16個，分別是β-谷甾醇、豆甾醇、胡蘿卜苷、常春藤皂甙元、木樨草素、三萜皂苷類、忍冬甙、灰氈毛忍冬皂苷、常春藤皂苷H、新長春皂苷等。三七33個，含有β-谷甾醇、豆甾醇、胡蘿卜苷、人參皂苷、三七皂苷、西洋參皂苷等。

圖2 銀芪軟膏的“藥物-成分-靶標-通路”圖

3 討論

糖尿病足潰瘍創面的處理一直是糖尿病足治療的難點和重點。在最新的指南里，中醫藥外治也是創面處理的重要手段之一[1]。銀芪軟膏是我國周圍血管科名老中醫龐鶴教授的經驗方，非常適用于中醫藥法關于經典名方的開發。銀芪軟膏由金銀花、黃芪、三七組成。金銀花為君藥，甘潤寒清，清熱解毒，為治熱毒所致的癰瘡疔癤的要藥。黃芪為佐藥，甘溫升補，又能托毒生肌，善治瘡瘍難潰難腐。三七散瘀止血，消腫定痛，能驅瘀毒。諸藥合用，既能清熱解毒，又能補虛托毒外出，驅逐瘀毒，起到去腐生肌之功。然而現階段中藥成分復雜，其作用機制難以闡明。

網絡藥理學融合了中藥學、化學、生物基因學、藥理學等多學科的大數據，利用計算機科學技術，形成多學科交叉，多層次融合的網絡，把原本孤立的中藥化學成分與疾病靶標等聯系起來，構建了中藥多成分與活性之間的關聯，為明確中藥藥效物質及其分子機制和進一步開發名醫名方提供了新的手段[5-6]。本研究正是從網絡藥理學角度出發，探討銀芪軟膏干預糖尿病足潰瘍的機制。

金銀花具有廣譜抗菌作用，對糖尿病足潰瘍感染的常見細菌如金黃色葡萄球菌等具有抑制作用[7]。研究發現，金銀花含有的綠原酸和異綠原酸具有明顯的抗菌作用[8]。除此之外，金銀花提取物還有改善胰島素抵抗的作用[9]。黃芪中黃芪總皂苷不僅能抑制細胞炎癥反應、保護內皮細胞，而且能降低血糖[10]。黃芪的黃酮類可通過調節核因子NF-κB信號通路抑制炎癥反應[11-12]。三七總皂苷可調節趨化因子2（CCL2）誘導的細胞內氧化應激來減輕細胞炎癥[13]。高愛社等[14]實驗證實三七總皂苷對損傷的內皮細胞具有修復作用。3味中藥的作用靶點均有重合，這提示藥物的之間存在藥效疊加的可能。

銀芪軟膏與糖尿病足潰瘍共有靶標1個，為ABL1，ABL1屬于非受體酪氨酸激酶，參與各種細胞過程，包括細胞生長和分裂、成熟和移動。在不同的細胞狀況下，它既可以幫助細胞生存，也觸發受控細胞凋亡。因此目前對ABL1的研究多在ABL1突變后引起的慢性骨髓性白血病[15]。至于ABL1與糖尿病足潰瘍關系鮮有文獻記錄，有待研究的進一步深入挖掘。

銀芪軟膏的主要活性成分可針對多個靶點、多條通路起到促進糖尿病足潰瘍恢復的作用。其作用可能與BH4的合成、eNOS激活、VEGFR2介導的血管通透性有關。BH4是內皮eNOS活性所必需的輔因子。eNOS產生的一氧化氮（NO）是血管穩態的關鍵介質，也是維持正常內皮功能的一個關鍵方面。eNOS的酶活性取決于其輔因子BH4的可用性。當BH4水平足夠時，eNOS產生NO；反之，當BH4水平受到限制時，eNOS會發生酶解偶聯并生成超氧化物，從而導致血管氧化應激和內皮功能障礙[16]。在高糖狀態下，BH4的合成會下降進而導致血管內皮受損。因此，BH4是修復糖尿病造成的內皮受損的治療靶點[17]。故銀芪軟膏可能是通過促進BH4的合成，來激發eNOS，實現維持血管內皮功能的正常，進一步促進糖尿病足潰瘍愈合。VEGFR2是已知的VEGF家族中血管生成和構造的主要調節者，它能夠提高血管通透性，也是參與內皮細胞的增殖、分化及血管的通透性的重要物質[18-19]。血管通透性與血管生成有密切關系，它能調節內皮屏障的開放，活化內皮細胞的功能[20]。

銀芪軟膏最大的靶標為HSP90AA1，是相關性最強的靶標。而在Reactome信號通路數據庫中，HSP90AA1涉及的通路包含BH4的合成、再循環、回收和調節，eNOS激活，VEGFR2介導的血管通透性，恰與銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍的通路一致，相較之下其他的靶標均不夠其全面，可推測其正是關鍵靶標。但目前關于HSP90AA1的研究都局限在它參與腫瘤細胞的分化、增殖和血管生成[21-22]。至于它是否也參與內皮細胞的血管再生有待深入研究。β-谷甾醇是3味中藥的共有的化學成分。有實驗表明β-谷甾醇通過促炎性細胞因子和趨化因子的釋放減少，抑制STAT1信號通路來抗炎[23-26]。除此之外，它還有降低血糖的作用[27]。

銀芪軟膏治療糖尿病足潰瘍效果顯著，此次對其分子機制及發揮作用的藥效物質基礎進行研究可以為銀芪軟膏及其所含中藥成分的進一步研究提供依據。但本研究是基于整合藥理學平臺的預測，具體機制乃至新藥開發還需要具體的實驗研究支撐。希望能以本研究為基礎，在實驗研究中得到進一步驗證。