獼猴桃潰瘍病枝條揮發(fā)物的GC-MS分析

周良強(qiáng)，汪 洋，張景榮，陳 莉，唐立忠，李 臻，卓 明*，黃昭賢

（1.四川省自然資源科學(xué)研究院，四川成都 610015；2.雅安市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川雅安 625000；3.四川省植物工程研究院，四川資中 641200）

獼猴桃（ActinidiaLindl.）富含多種氨基酸、礦物質(zhì)和維生素C，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與保健功效，現(xiàn)已成為許多地區(qū)的經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)［1-3］。獼猴桃果肉顏色多樣，其中，紅心獼猴桃口感佳、色彩美，頗受消費(fèi)者青睞。自1997年世界上首個(gè)紅心獼猴桃品種——中華獼猴桃‘紅陽’育成以來，紅肉品種的選育成為了研究熱點(diǎn)。爾后，以‘紅陽’獼猴桃為材料選育出一系列紅肉新品種，如‘紅華’‘晚紅’‘東紅’‘紅什1 號(hào)’［4-7］，已作為我國(guó)獼猴桃育種中最主要的骨干親本［8］。紅心類型的獼猴桃品種，雖然其食用品質(zhì)優(yōu)異，但大多對(duì)潰瘍病敏感［9］，目前，主流學(xué)者認(rèn)為該病由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomo?nas syringaepv.Actinidiae，Psa）引起。獼猴桃潰瘍病具有傳播快、致病力強(qiáng)、難治愈等特點(diǎn)，是一種毀滅性的病害，可導(dǎo)致短期內(nèi)大面積植株死亡，給生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失［10］。四川是全國(guó)獼猴桃主要產(chǎn)區(qū)之一，近年全省獼猴桃種植面積逐年增加，產(chǎn)量位居全國(guó)前列，其中，紅心獼猴桃產(chǎn)量占全國(guó)紅心獼猴桃的90%以上［11］。獼猴桃潰瘍病在四川省各大栽培區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，近年來呈現(xiàn)逐步蔓延、病情不斷加重的趨勢(shì)。以往對(duì)獼猴桃潰瘍病的研究多側(cè)重于防治策略，包括農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治方法［12-13］。最近，李亞巍等對(duì)該病菌在田間感病獼猴桃植株上的分布情況及侵染后的傳播規(guī)律進(jìn)行了報(bào)道［14］；李靖等鑒定了四川主栽獼猴桃品種對(duì)潰瘍病的抵抗能力［15］。

獼猴桃潰瘍病會(huì)導(dǎo)致植株產(chǎn)生抗感生理反應(yīng)，引起體內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化。迄今對(duì)獼猴桃組織中揮發(fā)性病理產(chǎn)物的研究尚未見報(bào)道。本研究運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS System）分別分析了‘紅陽’獼猴桃健康植株枝條與感潰瘍病枝條的韌皮部、木質(zhì)部及髓心組織中揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物的種類和含量差異，旨在為探索獼猴桃潰瘍病的病理和抗性機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020年3—5月，值獼猴桃潰瘍病高發(fā)期，分別于雅安市的名山區(qū)、雨城區(qū)、蘆山縣采集‘紅陽’獼猴桃感病枝條；在成都雙流一個(gè)9 年未發(fā)生潰瘍病的獼猴桃園區(qū)采集健康枝條。采后，先用超純水洗去枝條表面的灰塵和雜質(zhì)，待晾干后在健康和染病枝條部位分離出韌皮部、木質(zhì)部、髓部三類組織，染病枝條在節(jié)間處病斑取樣，對(duì)照選取與感病枝條同等枝齡和粗度的健康枝條。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

每個(gè)樣品取0.2 g 放入裝有吸附劑PorapakQ80/100的提取管中，密閉吸附48 h 后，去除樣品，加入適量正己烷浸泡30 min。取上清液再經(jīng)微孔過濾膜過濾后置于進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

1.2.2 揮發(fā)物檢測(cè)

采用安捷倫7890B-7000D氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱為HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm），進(jìn)樣量為1 μL，升溫程序?yàn)?0 ℃保持3 min，之后以每分鐘上升6 ℃到280 ℃，保持3 min，最后以每分鐘上升6 ℃到310 ℃，保持10 min。載氣為高純氦氣。離子源溫度為280 ℃，質(zhì)譜掃描范圍m/z為50～500。

1.2.3 揮發(fā)物定性與半定量

根據(jù)GC/MS 總離子圖，對(duì)各色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖進(jìn)行解析，通過檢索比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫（NIST14），并結(jié)合匹配分?jǐn)?shù)、各成分的保留時(shí)間、質(zhì)譜裂片圖及文獻(xiàn)查對(duì)，鑒定其化學(xué)成分。采用離子流峰面積歸一化法計(jì)算各揮發(fā)物組分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康和潰瘍病獼猴桃枝條揮發(fā)物總離子流圖

通過動(dòng)態(tài)頂空吸附法+氣相色譜-質(zhì)譜法分離到多種化學(xué)成分，得到健康和潰瘍病獼猴桃枝條的韌皮組織、木質(zhì)組織和髓心樣品揮發(fā)物成分檢測(cè)的總離子流圖（見圖1、圖2）。

圖1 獼猴桃健康枝條的韌皮組織、木質(zhì)組織和髓心揮發(fā)物成分檢測(cè)總離子流圖

圖2 獼猴桃潰瘍病枝條的韌皮組織、木質(zhì)組織和髓心揮發(fā)物成分檢測(cè)總離子流圖

通過CAS 號(hào)檢索和文獻(xiàn)核對(duì)，在健康枝條和潰瘍病枝條的韌皮組織、木質(zhì)組織和髓心中共鑒定出81 個(gè)化合物（見表1），其中苯環(huán)類化合物25個(gè)、烷烴類23 個(gè)、烯烴類11 個(gè)、醇類4 個(gè)、酚類4個(gè)、酯類3 個(gè)、呋喃類3 個(gè)、雜環(huán)類化合物2 個(gè)、酮類2 個(gè)、醛類2 個(gè)，含氮和含碘化合物各1 個(gè)。按離子流峰面積歸一化計(jì)算各揮發(fā)物組分的相對(duì)含量，結(jié)果顯示在健康和感病枝條的韌皮組織、木質(zhì)組織和髓心中，均以1,2-二乙苯含量最高，達(dá)65%以上。

表1 健康與感潰瘍病獼猴桃枝條的揮發(fā)物主要成分及相對(duì)含量

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

2.2 健康與感病枝條揮發(fā)性化合物組分差異

由表1 可知，健康枝條與感病枝條3 種不同組織的化學(xué)成分組成存在明顯差異的有22個(gè)，包括苯環(huán)類化合物、醇類、酚類、烷烴類、烯烴類，其中，4-丙基甲苯（C10H14）、1-丁烷-2-基-2,4-二甲基苯（C12H18）、香芹酚（C10H14O）、乙酸橙花叔醇酯（C17H28O2）、柏木腦（C15H26O）和3,4-環(huán)氧四氫呋喃（C20H30O4）等14 個(gè)成分僅存在于健康獼猴桃枝條中，而2-乙基甲苯（C9H12）、1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）苯（C10H12）、5-甲基-2,3-二氫-1H-茚（C10H12）、2,3,5,6-四甲基苯酚（C10H14O）和2,6,11,15-四甲基十六烷（C20H42）等8 個(gè)化合物僅存在于潰瘍病獼猴桃枝條中。

2.3 健康與感病枝條揮發(fā)性化合物相同組分含量變化

健康獼猴桃枝條與潰瘍病獼猴桃枝條共有59個(gè)相同揮發(fā)性化合物，其中有些成分的含量在二者中存在較大的差異。與健康枝條相比，在感病枝條中，對(duì)二乙基苯（C10H14）含量大幅增高，而4-乙基甲苯（C9H12）、3-乙基苯甲醛（C10H12）、4-異丙基苯甲醇（C10H14O）、正十七烷（C17H36）和正十八烷（C18H38）等含量明顯降低。

3 結(jié)論與討論

本研究采用頂空固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用（GCMS）的方法，分析了獼猴桃健康和感潰瘍病枝條揮發(fā)物的成分。從健康和感病枝條中，共測(cè)定出苯乙烯（C8H8）、正丙基苯（C9H12）、油酸酰胺（C18H35NO）等81 種揮發(fā)物組分，結(jié)果表明健康和感潰瘍病獼猴桃枝條揮發(fā)物的主要成分為1,2-二乙苯（C10H14）、2,4-二甲基苯乙烯（C10H12）和對(duì)乙基苯乙酮（C10H12O），二者揮發(fā)性化學(xué)物種類差異較大，且部分相同化合物的含量也存在明顯差異。在枝條的木質(zhì)組織中，揮發(fā)物中的萘（C10H12）、油酸酰胺（C18H35NO）和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（C15H24O）3 種物質(zhì)含量感病枝比健康枝低，感病枝分別為健康枝的23%、19%和16%。而2-乙基甲苯（C9H12）、1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）苯（C10H12）、2,3,5,6-四甲基苯酚（C10H14O）、5-甲基-2,3-二氫-1H-茚（C10H12）等8 個(gè)化合物僅在感病枝中檢測(cè)出。由此可見，獼猴桃枝條感染潰瘍病后其揮發(fā)物的含量發(fā)生了明顯的變化。有研究表明，植物受到病蟲害的侵害時(shí)，會(huì)產(chǎn)生許多次生代謝物質(zhì)來進(jìn)行調(diào)節(jié)，以抵抗病蟲害的侵襲［16］。

關(guān)于獼猴桃潰瘍病的致病機(jī)制，普遍認(rèn)為是丁香假單孢細(xì)菌感染所致。而本研究中，在染病枝條中還發(fā)現(xiàn)真菌侵染。本文發(fā)現(xiàn)的差異揮發(fā)物可能是獼猴桃在遭受病原侵害后的病理代謝產(chǎn)生，也可能由病原代謝的合成或降解所產(chǎn)生。有研究者在感病枝條中普遍發(fā)現(xiàn)小蠹蟲，從而認(rèn)為該病害是由小蠹蟲為害引起［17］。大量的研究證實(shí)，植物揮發(fā)物對(duì)昆蟲產(chǎn)生引誘或驅(qū)避作用［18-20］。本研究中，感染潰瘍病后枝條的特有揮發(fā)物質(zhì)，也可能與植物驅(qū)避小蠹蟲等昆蟲的生理生化作用有關(guān)。有關(guān)上述問題的科學(xué)解答，還需要進(jìn)一步研究。