肌酸激酶在杜氏肌營養不良癥新生兒篩查中的應用研究

許佳 牟凱 李雨雨 李洪俞 宋海波

摘要：目的 將肌酸激酶MM同工酶（ CK-MM）用于新生兒杜氏肌營養不良癥（DMD）篩查，為該病在魯中地區防治提供及時可靠的診斷依據。方法 收集男性新生兒濾紙干血片樣本10 376份，采用時間分辨熒光法檢測CK-MM，統計分析CK-MM值并設定需要進行基因檢測的臨界值，對篩查陽性的樣本進行DMD基因檢測。結果 時間分辨熒光法檢測CK-MM的批內CV、批間CV和平均偏移均<10%，DMD患兒CK-MM濃度臨界值可設為700ng/mL。結論 以濾紙干血片為樣本檢測CK-MM篩查DMD患兒有區域差異，但檢測方法簡便，值得臨床推廣。

關鍵詞：杜氏肌營養不良癥;肌酸激酶同工酶;新生兒篩查;濾紙干血片

【中圖分類號】R272.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）03-049-02

假性肥大型進行性肌營養不良癥包括杜氏肌營養不良和貝克氏肌營養不良兩種臨床類型，二者是等位基因異質性疾病，發病率分別為活產男嬰的1/3，500和1/30，000[1]，其中杜氏肌營養不良癥是肌

營養不良中最常見和最嚴重的類型，由于基因突變影響dystrophin蛋白在橫紋肌組織的表達，導致肢體近端骨骼肌進行性萎縮，無力和腓腸肌假性肥大，典型表現為運動發育遲緩，甚至倒退、特殊的“鴨步”步態，血清肌酸磷酸激酶（CK）活性升高，心肌細胞損傷。在DMD的情況下，早期使用皮質類固醇進行干預，在許多國家，包括中國，經常延遲和不經常使用皮質類固醇，延長了行走時間，提高了生活質量[1，2]。此外，對7歲以上的男孩進行的研究性遺傳治療（例如，外顯子跳過）正在進行第3階段臨床試驗，該階段的臨床試驗中使用了outcom。因此，新生兒篩查（NBS）對那些在生命早期就有資格接受這些治療的患者進行鑒別是非常重要的。2012年，Mendell等人[3]報告了DMD-NBS的一種新的兩步方法，在新生兒干燥血斑上檢測肌酸磷酸激酶（CK），然后在CK升高的樣本上直接檢測DMD基因。這種方法為中國等國家提供了一個利用CK標記物診斷DMD患者的機會。2019年7月，淄博市婦幼保健院在山東范圍內率先啟用美國PE公司的全自動免疫熒光分析儀（GSP）和全自動打孔儀Panthera-Puncher 9系統，實現DMD項目打孔檢測自動化，在山東省范圍內率先使用GSP開展新生兒男嬰的CK-MM的科研檢測項目。截止到2020年2月，我院共完成CK-MM檢測10376人次。

本文通過對在GSP上完成CK-MM篩查的10376人次數據進行分析，使用百分位數法和應試者操作特征曲線（ROC）研究在GSP上DMD篩查的最佳CK-MM切值點。

1材料與方法

1.1研究材料

2019年7月-2020年1月全市范圍內出生的活產男性新生兒10376例。新生兒在出生72小時后且7天內，并經充分哺乳6次以上，采集新生兒足跟血滴于S&S903濾紙上，自然干燥后于2-8℃冷藏，7天內送達淄博市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心實驗室，標本送達后5天內完成檢測。

1.2檢測儀器與方法

采用全自動打孔儀Panthera-Puncher 9打血班，在PE公司的GSP上上機檢測;試劑為PE公司GSP配套CK-MM項目檢測試劑盒，采用時間分辨免疫熒光法（DELFIA）。

1.3實驗室質量控制

檢測板為標準 96 孔微孔板，每板均設三個濃度的質控品做為質控物，每個質控品測定一次。本新生兒疾病篩查中心實驗室接受國家衛生部臨床檢驗中心新生兒疾病篩查實驗室室間質量評價，DMD項目作為調查項目，結果合格，室內質控結果統計如下：

1.4切值建立方法

使用IBM SPSS Statistics 21.0軟件運用百分位數法和ROC曲線法進行統計學分析。

2結果

2.1自2019年 7月至 2020 年2月，10376例男性新生兒CK-MM濃度呈偏態分布，其中有 5例CK-MM≥650ng/mL，占0.048%。經重采血復查后，仍有1例CK-MM≥700ng/mL。

2.2 10376例新生兒樣本，其CK-MM初篩樣本基本情況見表2，其樣本濃度頻率分布見表3。CK-MM分布在9.1-1807.2 ng/mL，其中CK-MM濃度在新生兒中數的分布呈對數正態分布，具有較高的置信度（P<0.005）。觀察到中位數測量的CK-MM濃度隨著年齡的增長而逐漸降低，如表4。

2.3 兩次篩查結果CK-MM≥700ng/mL的患兒經MLPA方法排除DMD基因突變，家屬拒絕進一步的神經肌肉疾病的診斷檢查。

3討論：

DMD是X連鎖隱性遺傳病，主要表現為進行性對稱性骨骼肌無力和萎縮，至今無治愈手段，通常男性發病。患兒出生時常無癥狀，發病隱匿，大部分患兒坐、立時間發育正常。DMD患兒首先出現的癥狀多為行走緩慢，隨后出現四肢近端、軀干和骨盆帶肌肉無力、肌張力低，蹲起和上樓困難，因盆帶肌無力走路時腰椎前突并呈典型鴨步步態。DMD突變基因女性攜帶者90%以上為表型正常，僅表現為血清肌酶輕到中度升高，少數可有DMD癥狀。發病年齡也由幼年到成年后的40或50歲，臨床表現可輕重不等，從一般的肌痛、痙攣到嚴重的肌無力均可出現，一小部分合并擴張型心肌病。淄博市2019年7月-2020年1月期間出生的男性嬰兒中未發現DMD患兒，這與王燕敏等[4]、楊小二等[5]報道有差異，新生兒DMD的發生存在地區差異。本研究由于局限于短期數據，尚不足以代表淄博地區整體的新生兒DMD發病情況，研究結論還有待于進一步收集驗證。

CK一直是DMD診斷的重要指標，但CK濃度易受年齡、性別、 種族、地域、運動狀態、疾病等多種因素的影響，且如何界定CK檢測值與DMD之間的關系尚無明確標準[6]。CK-MM是CK在骨骼肌中存在的主要同工酶形式，CK-MM作為骨骼肌損傷的指標比CK更具特異性。而切值是篩查工作中診斷和治療的重要依據，篩查切值是否準確直接影響篩查實驗室的工作質量，太高會引起漏診，太低會引起人力、物力的浪費。國內暫未形成新生兒DMD篩查標準，DMD陽性切值的合理設定是DMD篩查的關鍵同時也是難點，尤其是早產兒或低體重兒對切值是否像CAH篩查一樣存在顯著影響，使DMD篩查面臨極大的挑戰[7]。

Dystrophin蛋白有多種亞型，表達的部位不盡相同，且各自擁有不同的啟動子，不同類型DMD基因突變可以決定患者的表型特征。Dystrophin蛋白在多個組織和器官中行使重要功能，所以DMD可累及多個系統。隨著患兒年齡的增長，肌無力、呼吸功能不全、肌肉骨骼畸形以及心肌受累的程度均會逐漸加重。此外，DMD患者多合并認知功能障礙、自閉癥譜系障礙和行為問題，但這些合并癥在疾病病程發展過程中進展不明顯。

參考文獻

[1]Mendell JR，Shilling C，Leslie ND，et al.Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy [J]，2012，71：304-313

[2]Bushby K，Finkel R，Birnkrant DJ，et al.Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy，part 2：implementation of multidisciplinary care[J].Lancet Neurol，2010，9：177-189.

[3]Mendell JR，Shilling C，Leslie ND，Flanigan KM，al-Dahhak R，Gastier-Foster J，et al.Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.Ann Neurol 2012;71：304-313.

[4]王燕敏，田國力，紀偉，張瀟分.肌酸激酶MM同工酶在新生兒杜氏肌營養不良癥篩查中的應用[J].檢驗醫學，2020，35（11）：1115-1119.

[5]楊小二，俞菁，胡荷宇，章莉，孫黎，龔波.肌酸磷酸激酶檢測聯合分子診斷技術篩查新生兒杜氏肌營養不良癥[J].中華檢驗醫學雜志，2015，38（01）：32-34.

[6]柯青，張利.Duchenne型肌營養不良癥自然病程演變規律 [J].中國現代神經疾病雜志，2015，15（5）：355-359.

[7]楊茹萊.杜氏肌營養不良臨床特點及診治進展[J].中國兒童保健雜志，2018，26（03）：233-235.

本課題受1、山東省醫藥衛生科技發展計劃資助，項目編號為2016WS0740、2017WS044;2、受國家重點研發計劃資助，項目編號2018YFC0114703。

淄博市婦幼保健院 255000