整體柱固定化胰蛋白酶反應器的設計及其在水解β-乳球蛋白中的應用

茅宇虹， 李仁寬， 葉秀云

(福州大學生物科學與工程學院， 福建省海洋酶工程重點實驗室， 福建 福州 350108)

0 引言

β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin, β-Lg)是牛乳中的主要蛋白質， 約占乳清總蛋白的80%. 由于母乳中不含該蛋白， β-乳球蛋白一直被認為是嬰幼兒的主要過敏原之一[1]. 酶法水解是降低蛋白質過敏性的常用方法. 胰蛋白酶(Trypsin, EC3.4.21.4)特異性水解精氨酸(Arg/R)和賴氨酸(Lys/K)的C端肽鍵. 通過胰蛋白酶水解β-乳球蛋白不僅可顯著降低其致敏性[2]， 還可釋放5種生物活性肽[3].

市售的胰蛋白酶主要來源于動物， 如牛胰臟和豬胰臟. 原料不足及分離純化成本高昂大大限制了其在食品工業中的廣泛應用. 固定化不僅可提高游離酶的穩定性， 還可實現其重復使用， 從而降低使用成本. 然而， 底物與產物在固定化酶反應器中的擴散局限性往往嚴重阻礙了固定化酶分子與底物的接觸， 從而引起水解效率的降低[4].

為了解決擴散限制問題， 基于整體柱的固定化胰蛋白酶近年來備受關注[5-7]. 整體柱是由單體、 引發劑與致孔劑等混合物通過熱引發或光引發聚合而成的整體材料[8]. 相較于傳統的多孔顆粒， 整體柱往往具有高孔隙率和低擴散限制的優點， 可避免因擴散及逆流問題所導致的底物與酶無法接觸[9-10]. 然而， 絕大多數所報道的固定化胰蛋白酶反應器專為質譜分析研究而設計， 處理的底物量往往為微克級. 這與應用于食品工業中蛋白質水解物的生產相距甚遠. 在食品工業的應用中， 固定化酶反應器不僅需具備高活性， 還需處理大量底物. 高底物處理量往往極易導致因底物和產物的殘留而引起的反應器堵塞問題. 理論上， 相對更大的孔徑可保證其在實際應用中的高流速與高處理量.

本研究旨在制備適用于生產蛋白質水解物的固定化胰蛋白酶反應器. 以修飾了醛基官能團的聚甲基丙烯酸甲酯的大孔徑(6.0、 2.1 μm)整體柱為載體， 通過共價固定制備系列固定化胰蛋白酶反應器. 從固定化得率、 酶比活及重復使用性等方面對其進行系統評價. 此外， 以β-乳球蛋白為底物， 探究反應器對該底物的水解效率. 前期工作已系統比較了不同水解環境(pH值、 無機鹽與有機溶劑)對固定化胰蛋白酶與游離胰蛋白酶的水解效率及酶切位點特異性的影響[11-13]. 因此， 本研究重點考察固定化酶反應器特有的參數-流速， 對水解蛋白質效率的影響.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據Toro-Sierra等[14]的方法， 以分離乳清蛋白粉為原材料， 通過膜分離得到β-乳球蛋白(干物質含量98.6%(質量分數)， β-乳球蛋白純度≥99%).

胰蛋白酶(Trypsin， 來源自牛胰臟)購自美國Sigma-Aldrich公司， 以Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)為底物的酶活≥10 000 U·mg-1. 鹽酸苯甲脒(benzamidine hydrochloride, BAHC)、 2-(N-嗎啉基)-乙磺酸(2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid， MES)、 2-甲基吡啶硼烷(2-borane picoline 2-PB)、 氰基硼酸(NaCNBH3)、 乙醇胺(ethanolamine)、 三(羥甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane， Tris)、 氯化鈉(NaCl)、 氫氧化鈉(NaOH)、 鹽酸(HCl)、 氯化鈣(CaCl2)、 醋酸(CH3COOH)、 乙醇(C2H6O)、 三氟乙酸(trifluoroacetic acid， TFA)、 二硫代蘇糖醇(dithiothreitol， DTT)、 氯乙酰胺(chloroacetamide， CAA)、 乙腈(C2H3N)等均購自美國Sigma-Aldrich公司， 其中乙腈為色譜純， 其余均為分析純.

1.2 固定化酶反應器的制備

基于整體柱的固定化胰蛋白酶反應器(monolith based immobilized trypsin reactors, MITRs)采用具有醛基官能團修飾的聚甲基丙烯酸甲酯整體柱(CIMTM-ALD)為載體. 該載體由BIA Separations d.o.o. 公司(斯洛文尼亞)提供， 其具體尺寸信息如圖1-A部分所示. 游離胰蛋白酶上的氨基與整體柱內表面官能團醛基通過席夫堿反應形成多點共價固定， 如圖1-C部分所示， 固定步驟如圖1-D部分所示.

圖1 CIMTM-ALD整體柱尺寸及胰蛋白酶固定化流程

胰蛋白酶固定得率R(mg/MITR)可由式(1)計算得， 其中溶液中胰蛋白酶含量通過液相色譜分析根據峰面積確定.

R=Δc×V1-c′×V2

(1)

其中： Δc為胰蛋白酶溶液固定前后的濃度差；V1為所用的胰蛋白酶溶液體積(5 mL)；c′為固定后沖洗液中的胰蛋白酶濃度；V2為所用沖洗液的體積(10 mL).

1.3 胰蛋白酶酶活的測定

1.3.1 游離胰蛋白酶的酶活

采用連續分光光度速率測定法(A253， 光程=1 cm)， 以BAEE為底物測定胰蛋白酶活性. 一個BAEE單位的胰蛋白酶酶活(U)為每分鐘產生0.001的ΔA253， pH值為7.8或8.7(0.1 mol·L-1Tris-HCl)， 反應溫度為25 ℃， 反應體積為3.20 mL.

1.3.2固定化胰蛋白酶的酶活

將MITR接入Akta系統后， 采用20 mL去離子水沖洗. 使用0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH=7.8或8.7)緩沖液預平衡反應器(5 mL·min-1)后， 將10 mL 10 mmol·L-1BAEE(0.1 mol·L-1Tris-HCl, pH=7.8或8.7)底物溶液以10 mL·min-1的流速通過MITR， 流出液通過自動收集器收集(每管2 mL). 為充分排除Akta體系死體積的影響， 取第3管收集液稀釋50倍后于253 nm處測定其吸光度. 固定化酶酶活U*為在該反應條件下每分鐘水解 BAEE產生 Nα-苯甲酰基-L-精氨酸(BA)的微摩爾量， 由式(2)計算得.U*可通過乘以系數270轉化為BAEE酶活單位U[15].

(2)

其中： ΔA為BAEE溶液通過MITR前后的吸光度差；F為流速(10 mL·min-1)； Di 為測定吸光度時的稀釋倍數(50)；L為光路徑(1 cm)；ε為BA在253 nm處的摩爾吸光數(808 mol-1·cm-1)[16].

1.4 固定化胰蛋白酶反應器滲透性的測定

在Akta系統中， 將去離子水分別以不同流速循環， 分別記錄Akta系統背壓與接入MITR后的背壓. 在相同流速下， 這兩個背壓值的差值即為由MITR所引起的壓降值. 根據Podgornik等[17]的研究， MITR的滲透性(B， m2)可根據其在不同流速下的壓降值公式(3)計算得.

(3)

其中：F為流速(mL·min-1)； Δp(MPa)為MITR所引起的壓降值；η為流體黏度(去離子水黏度為0.877 mPa·s)；D、d與h分別為MITR的外徑、 內徑與高度(m)(見圖1-A部分).

1.5 β-乳球蛋白的水解

底物預處理： β-乳球蛋白粉于去離子水中攪拌溶解過夜(4 ℃, 150 r·min-1磁力攪拌). 放置至室溫后將pH值調節至4.6， 離心去除沉淀蛋白.

所有水解反應均在Akta系統中以循環模式進行(25±1 ℃)， 各水解條件分別進行3次平行實驗， 且以隨機錯開模式安排實驗順序， 減少MITRs因使用性能下降所導致的實驗結果偏差. 每次實驗后， 分別采用20 mL去離子水， 100 mL 0.5 mmol·L-1NaOH + 5 mmol·L-1NaCL溶液(pH=10.5)以及50 mL去離子水清洗MITR(5 mL·min-1)， 并采用20 mL含1 mmol·L-1CaCl2與5%(體積分數)乙醇的20 mmol·L-1醋酸溶液(pH=3.5)潤洗后儲存于4 ℃環境中.

1.5.1流速的影響

20 mL 0.1 mol·L-1Tris-HCl 緩沖液預平衡MITRs后， 用16 mL 底物溶液(10 mg·mL-1， pH=8.7)以10 mL·min-1的流速潤洗MITR， 剩余的100 mL底物溶液于不同流速下進行循環水解. 在水解過程中， 分別于不同時間取樣1 mL待分析.

1.5.2 pH-stat水解模式

MITR經預平衡及底物溶液潤洗后， 100 mL β-乳球蛋白溶液(10 mg·mL-1)以15 mL·min-1的流速循環通過MITR. 采用pH-stat水解法， 通過滴加0.1 mol·L-1的NaOH溶液維持水解過程中pH值的穩定， 并通過實時記錄所用的NaOH溶液體積計算水解度. 水解度(degree of hydrolysis, DH)可根據式(4)計算得[18]. 在水解過程中， 分別于不同間隔時間取樣1 mL待分析.

(4)

1.6 β-乳球蛋白的定量分析

通過高效液相色譜(reversed-phase high-performance liquid chromatography， RP-HPLC)定量分析β-乳球蛋白的含量. 所采用的HPLC系統為安捷倫1100系列(美國Agilent Technologies公司)， 色譜柱為PLRP-S-300 ?(150 mm ×4.6 mm， 德國Eppelheim公司). 將各待測樣品稀釋2倍后調節其pH值至4.6， 采用0.45 μm纖維素膜過濾該樣品后， 取20 μL進行分析. 洗脫液A為含0.10%(體積分數， 下同)TFA的去離子水， 洗脫液B為含0.05%TFA的80%乙腈/水溶液. 洗脫梯度： 溶劑B的體積分數由起始的43%于13 min內增加55%. 流動相的流速恒定為1.0 mL·min-1， 溫度40 ℃， 紫外檢測器的檢測波長226 nm.

以純度為99%的β-乳球蛋白A與B(美國Sigma Aldrich公司)為標準品建立標準曲線后， 根據樣品的保留時間及峰面積計算樣品中β-乳球蛋白的含量.

1.7 水解產物的HPLC分析

表1 水解產物色譜分析的洗脫液梯度

預處理(還原二硫鍵)： 將水解產物樣品用去離子水稀釋2倍后取1 mL加入150 μL 80 mmol·L-1的DTT并震蕩45 min(pH=8， 溫度37 ℃)， 然后加入200 μL CAA(400 mmol·L-1)混合均勻后于黑暗環境中靜置30 min.

采用安捷倫1100系列HPLC系統分析. 色譜柱型號為Kinetex-XB-C18-100 ?(100 mm ×4.6 mm， 美國Phenomenex公司). 流動相與節1.6中所述一致. 洗脫梯度如表1所示. 該分析在60 ℃和1.5 mL·min-1的流速下進行， 紫外檢測器的檢測波長為214 nm.

1.8 數據處理

色譜數據采用安捷倫ChemStation分析. 其它實驗數據采用Origin 2018計算分析并作圖.

2 結果與分析

2.1 固定化胰蛋白酶反應器的表征

2.1.1 胰蛋白酶的固定化得率

本研究比較不同還原劑體系對胰蛋白酶固定化得率及活性的影響， 結果如表2所示. 還原劑2-PB的使用導致了胰蛋白酶固載量的顯著降低. 這可能是因為2-PB分子相較于其他兩種還原劑較大， 限制了其還原席夫堿的能力[19]. 由于2-PB參與的還原反應相對溫和， 對蛋白結構影響小， 因此方案1中的固定化胰蛋白酶的酶活顯著高于其它方案. 鑒于NaBH4對蛋白結構的破壞性， 該還原劑僅于封閉殘留官能團時使用， 并未在固定化過程中應用. 胰蛋白酶的固載量在方案2、 3中并無顯著變化， 但應用NaBH4依舊降低了固定化胰蛋白酶的比活. 據生產商信息， 孔徑大小分別為2.1和6.0 μm的整體柱的表面積分別為5.0和2.0 m2·g-1. 由于比表面積的減少， 6.0 μm-MITR中酶的總固載量均顯著少于2.1 μm-MITR. 然而， 結合MITRs的固有表面積， 6.0 μm-MITR中的胰蛋白酶分子單位固載率為0.75～1.60 mg·m-2， 高于2.1 μm-MITR(0.68～1.00 mg·m-2). 這說明整體柱孔徑的增大事實上有助于酶分子的固定.

據報道， 游離胰蛋白酶的最適pH值為 7.8～8.1， pH值的升高或降低往往導致酶蛋白結構的變化從而影響其活性[3]. 如表2所示， 相較于pH=7.8， 游離胰蛋白酶的酶活在pH=8.7時降低了18.6%， 而多點共價固定的胰蛋白酶的比活不僅沒有降低， 還均略微增加. 然而， 共價固定法易造成酶分子靈活性的降低并可能引起空間位阻， 從而降低固定化酶的活性. 本研究中， 固定化胰蛋白酶的比活相較于其游離態降低了50%～80%.

表2 不同方案下胰蛋白酶固定于ALD-CIMTM 整體柱的得率及酶活

2.1.2固定化酶反應器的柱壓及滲透性

6個MITRs在不同流速下的柱壓均呈線性上升， 如圖2(a)所示. 這表明所使用的整體柱材料在15 mL·min-1的流速下沒有發生壓縮形變. 2.1 μm-MITR在15 mL·min-1時柱壓為0.20～0.25 MPa， 而6.0 μm-MITR在該流速下的柱壓低于0.05 MPa. 據生產商信息， 該整體柱耐受柱壓可高至2.0 MPa， 因此理論上可在更高流速下應用. 根據不同流速下的柱壓及公式(3)計算所得的滲透性如圖2(b)所示. 在孔隙率不變的情況下， 所用整體柱的孔徑由2.1 μm 增加到6.0 μm， 滲透性增加了5倍左右.

圖2 不同流速下MITRs的柱壓及滲透性.

2.2 固定化胰蛋白酶水解β-乳球蛋白

N3與N4的總酶活最高， 因此被用于β-乳球蛋白的水解實驗. 此外， 固定化胰蛋白酶的酶活在pH=8.7時高于pH=7.8時， 因此水解反應在pH=8.7下進行.

2.2.1流速的影響

在基于大孔整體柱的反應器中， 底物主要通過對流方式與固定化酶接觸， 因此傳質速度主要由流速決定. 本研究比較N3、 N4在不同流速下水解β-乳球蛋白的能力， 結果如圖3所示. 無論是2.1 μm還是6.0 μm孔徑的MITR， 其水解β-乳球蛋白的能力均隨著循環流速的增大而增加. 例如， 在0.5 mL·min-1的流速下， N3在2 h內可水解25%β-乳球蛋白， 而在同樣水解時間下將循環流速提高至10.0 mL·min-1， 50%β-乳球蛋白被降解. 顯然， 流速的提高大大增加了MITRs內的傳質效率， 因此提高了其水解底物蛋白的能力.

圖3 N3與N4在不同流速下水解β-乳球蛋白的效率

2.2.2 pH-stat法水解模式

圖4 N3與N4循環水解β-乳球蛋白過程中水解度與殘留β-乳球蛋白含量的變化

理論上， 胰蛋白酶水解β-乳球蛋白最大水解度可達11.11%[3]. 經過6 h的循環水解， 水解度分別為10.1%(N3)與6.9%(N4)， 如圖4所示. 其中， 使用N3的水解度在最后的1 h內只增加了0.2%， 說明其水解度已接近最大值. N3的整體酶活是N4的1.5倍， 這與兩者水解β-乳球蛋白的效率十分相符. 由此可見， N3與N4的孔徑差異對傳質效率并無明顯影響. 此外， 在前期研究中[11]， 游離胰蛋白酶水解β-乳球蛋白往往在初期反應迅速， 隨后由于底物的減少以及游離酶的自降解而逐漸減緩. 固定化胰蛋白酶雖避免了自降解問題， 但由于其靈活性的降低， 并未出現初期十分迅速的反應階段. 此外， 水解過程中殘留蛋白含量的變化如圖4(藍色)所示. 在240 min時(DH 8.8%)， N3的水解產物中幾乎已檢測不到完整的β-乳球蛋白， 而采用N4水解360 min后， 14.2%β-乳球蛋白還未被降解.

2.2.3水解產物的分析

將經N3與N4水解的β-乳球蛋白水解物分別經含10 ku與3 ku過濾膜的離心管過濾后采用高效液相色譜分析， 結果如圖5所示.

圖5 N3與N4水解β-乳球蛋白產物的色譜分析

N3的水解產物在過濾前后無明顯變化， 說明該水解產物的相對分子質量均小于3 ku(圖5(a))； 而N4的水解產物中依舊含有相對分子質量大于10 ku的多肽(見圖5(b)). 此外， 較多在N3水解產物中檢測到的肽， 并未出現在N4的水解產物中. 這說明這些肽在水解反應的后期釋放.

2.3 固定化酶反應器使用的重復性

MITRs的穩定性和可重復使用性取決于酶活以及滲透性(柱壓)的穩定性. 為了系統研究孔徑大小對其的影響， N3與N4被重復用于β-乳球蛋白的水解實驗. 在10 mg·mL-1的β-乳球蛋白溶液的單次6 h循環水解實驗中， 柱壓的變化如圖6所示. 由于N3孔徑較小， 其背壓約為N4的4倍. 此外， 在6 h的連續水解實驗中， N3的柱壓從0.30 MPa增加到0.33 MPa， 而N4的背壓幾乎完全保持不變. 這可能是由于β-乳球蛋白分子及其水解產物在N3中的非特異性吸附.

為了探究該非特異性吸附問題是否可通過現有的沖洗步驟消除， 本研究在每次水解實驗及清洗后均記錄N3與N4的滲透性以及酶活. 在用N4水解β-乳球蛋白(10 mg·mL-1)的18次實驗中(前3次循環為6 h， 其余每次持續3 h)， 酶活性和柱壓基本保持不變， 如圖7所示. 對于N3， 其柱壓在前10個循環中并沒有明顯下降， 這表明沖洗步驟具有一定效果. 然而， 隨著使用次數的不斷累積， N3的滲透性逐漸下降. 有趣的是N3的酶活在18次重復使用中幾乎沒有顯著變化. 此外， 在連續水解實驗后， N3與N4于4 ℃儲存超過30周， 其酶活和滲透性均十分穩定.

圖6 N3與N4水解β-乳球蛋白溶液時的柱壓變化

圖7 N3與N4在18次重復使用中酶活與滲透性的變化

3 結語

本研究采用大孔徑(2.1 μm與6.0 μm)的有機整體柱為載體， 比較不同還原劑對所制備的固定化酶反應器的固載量及酶比活的影響. 相對溫和的2-甲基吡啶硼烷可提高酶的比活但大大降低了固載量. 所制備的MITRs可有效水解β-乳球蛋白， 其中2.1 μm-MITR可在6 h內使100 mL 10 mg·mL-1的β-乳球蛋白溶液水解度達到10.1%(理論最大值為11.1%)， 該水解產物主要為相對分子質量于3 ku的小肽. 值得注意的是， 本研究中的水解時間為循環時間. 由于MITRs的孔體積為0.6 mL， 固定化胰蛋白酶與底物的有效接觸時間比循環時間短得多. 此外， 2.1 μm-MITR 在10次重復使用后， 由于現有的清洗方法無法完全去除殘留的蛋白質， 其柱壓逐漸上升但酶活幾乎保持不變. 6.0 μm-MITR的柱壓及酶活在18次重復使用中均十分穩定.