蘇北地區奶牛場無乳鏈球菌分離株毒力分析

馬芳 周明旭 張金秋 楊世芳 盧宇 鄧碧華

摘要：奶牛乳腺炎導致奶牛產奶量下降和乳制品質量降低，是奶牛養殖業重要的經濟性疾病，在全球范圍內造成巨大經濟損失。選取蘇北奶牛場3株代表性無乳鏈球菌分離株，SAG-FX17分離自臨床型乳腺炎、CM31分離自隱性乳腺炎和CM41b分離自隱性發展為臨床型乳腺炎奶牛乳汁，研究比較3株細菌生長特性、毒力因子分布、形成生物被膜能力及其對奶牛乳腺上皮細胞的黏附、侵襲和胞內存活能力。試驗結果表明，3株分離株血清型均為Ⅰa型，2b型菌毛，gapC基因和cylE基因陽性，但僅SAG-FX17的α相關蛋白家族為Alp1型，其他2株為未定型。研究發現 SAG-FX17 與奶牛乳腺上皮細胞（Mac-T）共孵育時生成生物被膜能力明顯增強，且該菌對Mac-T細胞黏附率為525%，顯著高于CM31和CM41b。侵襲試驗結果表明，3株細菌侵襲到細菌內部的能力很低，但侵襲到細胞內的細菌具有一定存活能力，侵入細胞4 h 3株分離株SAG-FX17、CM31、CM41b存活率分別為24%、18%、86.7%。綜上所述，無乳鏈球菌在奶牛乳腺上皮細胞表面形成生物被膜及其在胞內存活能力是影響細菌致病性的重要因素。

關鍵詞：無乳鏈球菌;毒力因子：生物被膜;黏附;胞內存活能力;奶牛場;蘇北地區

中圖分類號： S852.6文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）05-0142-08

奶牛乳腺炎是奶牛最常發病、治療費用最高的疾病，全世界約有1/3奶?；加腥橄傺祝瑢е屡Ｄ坍a量和質量嚴重下降，造成巨大經濟損失。奶牛乳腺炎根據癥狀分為臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎。臨床型乳腺炎發病急、癥狀明顯;隱性乳腺炎一般難以直接觀察到臨床感染癥狀，不能及時隔離、治療，容易被忽視，但其具備轉化為臨床型乳腺炎的風險，給奶牛養殖業帶來嚴重影響[3]。

奶牛乳腺炎的致病因素包括病原體、宿主和環境因素，其中細菌乳腺內感染為最主要因素[4]。宿主與病原微生物互相作用結果的不同，細菌感染引起乳腺炎臨床表現不同，如金黃色葡萄球菌黏附侵襲到宿主細胞內部并逃避宿主先天性免疫反應，易導致隱性乳腺炎;大腸桿菌感染后大量增殖釋放毒素引起宿主細胞因子釋放，易導致臨床型乳腺炎[5]。葡萄球菌和鏈球菌是導致奶牛乳腺炎最常見的和造成經濟損失最大的致病菌，無乳鏈球菌雖然只在乳腺組織內生長和增殖，但該菌可以在乳腺組織外短時間存活，同時通常會導致隱性乳腺炎，因此牛場一旦感染，極易導致該菌傳播擴散[6]。1887年無乳鏈球菌作為奶牛乳腺炎致病菌首次被鑒定，后來發現該菌還可以造成人類尤其懷孕女性、早產兒和新生兒感染[7]。無乳鏈球菌又稱為B族鏈球菌，屬于革蘭氏陽性菌，根據莢膜多糖抗原性與結構特點分為10個血清型（Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ），其中85%～90%的臨床分離株為Ⅰa、Ⅰb、Ⅲ和Ⅴ型[8]。

無乳鏈球菌感染機制主要包括以下3種機制：（1）定植和穿越組織屏障;（2）逃避宿主防御機制;（3）表達毒力因子[7]。細菌黏附乳腺上皮細胞并侵入到細胞內部是細菌引起乳腺炎的重要機制。無乳鏈球菌經乳頭感染定殖于乳腺細胞和乳導管并大量繁殖，導致乳腺上皮細胞損傷。大量中性粒細胞涌入阻塞乳導管，影響泌乳和細菌排出，進而引起腺泡退化喪失泌乳機能。無乳鏈球菌編碼大量毒力因子對該菌的致病力起到關鍵作用，如產生 β-溶血素裂解細胞[8]。同時，毒力因子也在無乳鏈球菌黏附、入侵宿主細胞過程中存在關鍵作用，因此對臨床分離細菌進行毒力因子檢測有利于更好地評價細菌致病性，也為進一步研究細菌感染宿主的機制提供理論依據。

前期研究在蘇北地區多個奶牛場進行采樣，獲得無乳鏈球菌6株，本試驗對其中3株典型無乳鏈球菌（SAG-FX17分離自臨床乳腺炎奶牛乳汁，CM31和CM41b分離自隱性乳腺炎奶牛乳汁，其中CM41b分離株宿主由陰性隱性感染轉臨床癥狀）進行研究比較，包括細菌毒力因子分布、生長特性及與細胞的互作特征等，為進一步研究無乳鏈球菌致奶牛乳腺炎的毒力機制提供理論支持，也為通過研制疫苗等方式預防奶牛無乳鏈球菌乳腺炎提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

無乳鏈球菌SAG-FX17、CM31、CM41b分別分離自蘇北地區奶牛養殖場并由江蘇省農業科學院動物免疫工程研究所疫苗制造工程研究室保存[9];奶牛乳腺上皮細胞Mac-T由江蘇省農業科學院動物免疫工程研究所疫苗制造工程研究室保存，37 ℃，5% CO2細胞培養箱培養。試劑 THB培養基、胰蛋白酶為英國Oxoid公司產品;結晶紫染色液瓊脂為南京翼飛雪生物科技有限公司產品;細菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產品;DMEM為Thermo Fisher Scientific公司產品;青霉素、鏈霉素為Sigma-Aldrich公司產品;2×TaqMaster Mix為南京諾唯贊生物科技股份有限公司產品。

1.2 細菌培養

將37 ℃ 180 r/min過夜培養的細菌以1 ∶100分別轉接到THB液體培養基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養至對數期，5 000 r/min離心5 min，收集菌體并用無菌PBS（8 mmol/L Na2HPO4、0.136 mol/L NaCl、2 mmol/L KH2PO4和2.6 mmol/L KCl）清洗3次，用于后續研究。

1.3 細菌生長曲線檢測

將過夜培養的細菌以1 ∶100分別轉接到 100 mL THB液體培養基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養，每隔1 h取樣檢測其D600 nm，連續檢測至細菌D600 nm保持穩定。

1.4 提基因組

取3 mL過夜培養的細菌通過5 000 r/min離心5 min收集于1.5 mL EP管中，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟提取細菌基因組DNA，最后以50 μL ddH2O溶解，提取基因組作為PCR反應模板備用。

1.5 毒力基因檢測

本研究對分離株的相關毒力基因包括莢膜多糖合成酶相關基因、β蛋白編碼基因bac、α相關蛋白基因（bca、alp1、rib、alp2、alp3和alp4的基因）、β-溶血素結構基因cylE、菌毛骨架蛋白編碼基因spb、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）編碼基因gapC、5a肽酶編碼基因scpB進行鑒定，僅模板用無菌超純水為陰性對照組。本研究中所用的引物見表1。PCR擴增程序為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共30個循環;72 ℃延伸 10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 乳酸脫氫酶（LDH）試驗

將奶牛乳腺上皮細胞（Mac-T）培養于96孔板中長至80%以上單層細胞，用無血清的DMEM清洗細胞3次，每孔加入200 μL無血清DMEM。細菌以MOI=10感染細胞，孵育3、4、5、6、24 h用LDH活性檢測試劑盒檢測450 nm下上清液的吸光度，陰性對照為無細菌感染的細胞組。

1.7 細菌黏附Mac-T細胞試驗

將Mac-T細胞培養于24孔板中長滿至少80%的單層細胞用無血清的DMEM清洗細胞3次，每孔加入無血清DMEM 500 μL。細菌以MOI=10感染細胞， 800g離心10min使細菌與細胞充分接觸，置于培養箱中作用1 h。對照組為等量細菌與DMEM孵育1 h。作用后，用無菌PBS清洗3次去掉沒有黏附的細菌。細胞中加入100 μL/孔無菌05% TritonX-100置于37 ℃培養箱中孵育5 min裂解細胞釋放細菌。黏附的細菌通過涂布THB平板進行定量，黏附率=（試驗組細菌數量/對照組細菌數量）×100%。

1.8 細菌侵襲試驗

將Mac-T細胞培養于24孔板中長滿至少80%的單層細胞，用無血清的DMEM清洗細胞3次，加入無血清DMEM 500 μL/孔。細菌以MOI=10感染細胞，800 g離心10 min使細菌與細胞充分接觸，置于細胞培養箱中作用2 h。作用后，用無菌PBS清洗3次清洗掉沒有黏附的細菌。細胞中加入1 mL/孔含有100 μg/mL慶大霉素和5 μg/mL青霉素G的DMEM并作用1 h殺死細胞外細菌。孵育后用無菌PBS清洗3次，加入100 μL/孔 0.5% TritonX-100孵育5 min裂解細胞釋放細菌，侵襲到細胞中的細菌通過涂布THB平板進行定量。對照組為等量細菌與DMEM孵育2 h后直接涂布THB平板定量。侵襲率=（試驗組細菌數量/對照組細菌數量）×100%。

1.9 細菌胞內存活試驗

將Mac-T細胞培養于24孔板中長滿至少80%的單層細胞，用無血清的DMEM清洗細胞3次，每孔加入無血清DMEM 500μL。細菌以MOI=10感染細胞，800g離心10 min使細菌與細胞充分接觸，置于細胞培養箱中作用2 h，作用后用無菌PBS清洗3次清洗掉沒有黏附的細菌。細胞中加入1 mL/孔含有100 μg/mL慶大霉素和5 μg/mL青霉素G的DMEM，分別孵育1、2、3、4 h殺死細胞外黏附的細菌。每個時間點試驗孔細胞用無菌PBS清洗3次，加入100 μL/孔 0.5% TritonX-100 孵育 5 min 裂解細胞釋放胞內活菌，涂布THB平板定量。細菌與Mac-T細胞作用2 h后，加入抗生素殺死胞外細菌，抗生素作用1 h所得細菌數定為胞內存活細菌總數為100%，分別計算抗生素作用2、3、4 h后的細菌存活率分別記為Δ1 h、Δ2 h、Δ3 h。Δnh胞內細菌存活率=×100%，n=1，2，3。

1.10 細菌體外生物被膜培養與檢測

將Mac-T細胞培養于96孔板中長至80%以上單層細胞，用無血清的DMEM清洗細胞3次，加入無血清DMEM 200 μL/孔，細菌以MOI=10感染細胞。陰性對照為沒有細菌感染的細胞組，同時設置僅有細菌沒有細胞的組為空白對照。將96孔細胞板置于細胞培養箱孵育24 h，孵育后將細胞板中的培養液棄去，用無菌PBS清洗3次，加 200 μL/孔 甲醇固定15 min，自然風干用后加 200 μL/孔 1%結晶紫染色液染色15 min，PBS清洗3次，自然干燥后細胞板中的生物被膜用BIO-RAD凝膠成像系統拍照。

1.11 數據處理

采用GraphpadPrism 5軟件和SPSS V25.0進行繪圖和數據分析。

2 結果與分析

2.1 細菌生長特性

3株奶牛乳汁無乳鏈球菌分離株SAG-FX17、CM31、CM41b在THB液體培養基中37 ℃振蕩培養，試驗重復3次。結果（圖1）顯示，3株細菌遲緩期、對數期和平臺期的生長曲線沒有明顯區別。說明細菌生長特性不是導致3株無乳鏈球菌毒力差異的原因。

2.2 主要毒力因子鑒定

通過多重PCR對莢膜多糖合成酶相關基因鑒定，結果（圖2-A）表明，3株無乳鏈球菌分離株SAG-FX17、CM31、CM41b均屬于Ⅰa型。對無乳鏈球菌3種菌毛骨架蛋白BP-1、BP-2a、BP-2b基因sbp1、sbp2a、sbp2b進行檢測，結果（圖2-B）表明3株菌都有2b型菌毛骨架蛋白基因spb2b。PCR檢測無乳鏈球菌β溶血素編碼基因cylE發現3株菌均攜帶該基因（圖2-C）。PCR鑒定無乳鏈球菌β蛋白編碼基因bac，結果（圖2-D）顯示3株菌均不攜帶該基因。ScpB編碼的C5a肽酶是一種滅活人C5a的絲氨酸表面結合蛋白酶，研究認為其可以阻止C5a與中性粒細胞結合，抑制炎癥時吞噬細胞的化學攻擊作用，結果（圖2-E）顯示3株分離株scpB基因為陰性。無乳鏈球菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）編碼基因gapC的PCR鑒定結果發現3株菌均為gapC陽性（圖2-F）。Alp家族是α相關蛋白家族的總稱，目前鑒定發現包括6個成員：α、Rib、Alp2、Alp3、Epilons（Alp1）和Alp4蛋白，這些蛋白僅重復序列數目不同，其他差異很小。通過PCR結果片段大小判斷菌株Alp結果，其中結果陰性判定為未定型，研究結果（圖2-G）顯示3株牛源無乳鏈球菌分離株7為Alp1型，其他2株為未定型。

2.3 LDH細胞毒性試驗

為了進一步驗證細菌對細胞的毒性，對細菌孵育細胞3、4、5、6、24 h后培養基中LDH進行定量。細胞膜結構破壞后會導致胞漿中酶活性較為穩定的乳酸脫氫酶釋放到培養液中，通過對培養液中LDH的檢測從而對細胞毒性進行定量。從圖3可以看出，細菌感染細胞6 h內對細胞活性影響不大。24 h后細菌對細胞的毒性明顯增強，但由于培養基中沒有加血清，所以陰性對照組細胞活性也明顯降低。研究結果表明，體外試驗中在感染前期細菌對細胞毒性較小，可以展開細菌對細胞的黏附、侵襲等研究。

2.4 細菌黏附Mac-T細胞能力

黏附試驗結果表明，3株無乳鏈球菌對奶牛乳腺上皮細胞Mac-T的黏附能力具有顯著差異（P<0.05）。從圖4可以看出，分離株SAG-FX17對Mac-T的黏附率高達52.5%;分離株CM31對 Mac-T 的黏附率在18%左右;而分離株CM41b對Mac-T的黏附率很低，僅在7%左右。

2.5 細菌侵襲Mac-T細胞能力

從圖5可以看出，3株牛源無乳鏈球菌分離株對奶牛乳腺上皮細胞Mac-T的侵襲力非常低，其中分離株SAG-FX17雖然對Mac-T的黏附率超過50%，但該菌對細胞的侵襲率僅為0.001%左右。分離株CM31和CM41b對Mac-T的侵襲率僅為0.000 3%和0.000 4%。該結果說明3株無乳鏈球菌均不易侵襲到奶牛乳腺上皮細胞內部。

2.6 細菌在Mac-T細胞中存活能力

從圖6可以看出，侵入到乳腺上皮細胞內部的無乳鏈球菌具有一定的存活能力，分離株SAG-FX17在侵入細胞內2 h（Δ1h）約49%的細菌存活，3 h后（Δ2 h）胞內細菌明顯地減少，僅26%的細菌存活，但4 h后（Δ3 h）仍有24%的細菌存活。僅有13%的CM31侵入細胞2 h后存活，但3、4 h后細菌的存活率沒有明顯的變化，分別為14%、18%，說明CM31分離株侵入細胞后大部分細菌會被殺死但仍有少量細菌能保持活力。分離株CM41b侵入細胞2 h后54%的細菌存活，3、4 h后胞內細菌反而增加，分別為88.4%、86.7%，說明細菌可能克服胞內殺菌活性，在細胞內存活并增殖。抗生素作用1 h所得細菌數定為胞內存活細菌總數，為100%，分別計算抗生素作用2、3、4 h后的細菌存活率，記為 Δ1 h、Δ2 h、Δ3 h。

2.7 細菌形成生物被膜能力

3株細菌在體外培養基中均不產生生物被膜，但當與細胞共孵育時分離株SAG-FX17形成生物被膜的能力明顯增強（圖7）。說明該細菌可能通過形成生物被膜黏附在奶牛乳腺上皮細胞表面，并增強細胞在體內的存活能力。

3 討論與結論

無乳鏈球菌又稱B族鏈球菌，能夠感染人、魚、奶牛等多種宿主。奶牛乳腺炎由多種致病因素，無乳鏈球菌是導致奶牛乳腺炎的主要致病菌，引起臨床型或隱性乳腺炎，導致牛奶產量和乳制品質量明顯下降，造成巨大的經濟損失[10]。本研究選取分離自蘇北奶牛養殖場且具有代表性的3株無乳鏈球菌作為研究對象，其中分離株SAG-FX17分離自臨床型乳腺炎奶牛乳汁，CM31和CM41b分離自隱性乳腺炎奶牛乳汁，其中CM41b分離株宿主由隱性轉為臨床型。因此比較3株代表性細菌的感染特性有利于進一步研究無乳鏈球菌的致病機制。

分泌毒力因子是無乳鏈球菌致病的重要機制之一，莢膜幫助細菌抵抗宿主吞噬細胞吞噬、逃避補體系統的作用，是該菌主要的毒力因子[11]。根據莢膜多糖的結構特征，無乳鏈球菌分為10個血清型，其中Ⅰa型和Ⅲ型為造成新生兒疾病和奶牛乳腺炎最常見的血清型，尤其Ⅰa型為人源和牛源感染的主要血清型[12]，本研究中3株奶牛乳汁分離株均為Ⅰa型，說明Ⅰa型為該地區無乳鏈球菌流行株的優勢血清型。無乳鏈球菌表面具有菌毛，分為1型和2菌毛，其中2型菌毛編碼基因包括2種不同序列的等位基因（分為2a型和2b型菌毛）。菌毛由骨架蛋白BP與輔助蛋白AP-1、AP-2共同組裝成完整結構，參與細菌黏附、侵襲等致病過程[13]，本研究中3株菌為2b型菌毛。scpB基因編碼的C5a肽酶是無乳鏈球菌常見的毒力因子，研究人源和牛源無乳鏈球菌時發現人源分離株菌含有該基因，而僅部分牛源分離株具有該基因[14]，本研究中3株菌缺乏該基因，可能為菌株適應宿主而缺失。gapC蛋白具有 3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）活性，是糖酵解的關鍵酶保守性高，在包括化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌等致病性鏈球菌細胞壁蛋白研究中均有報道，gapC蛋白分泌到細菌表面后與宿主細胞外間質互作，幫助細菌黏附侵襲[15]。β溶血素不僅具有紅細胞毒性而且能溶解多種真核細胞導致細胞死亡，又稱溶細胞素，研究表明具有β溶血素的無乳鏈球菌菌株毒力明顯高于非溶血性菌株。本研究中3株細菌gapC基因和β溶血素編碼基因cylE均為陽性。α相關蛋白家族是無乳鏈球菌重要的具有保護性表位的表面蛋白家族，目前已鑒定出6個成員，分別為α、Rib、Alp2、Alp3、Epilons和ALP4蛋白，由等位基因編碼，同一個菌株只能表達α相關蛋白家族中的1個蛋白[16]。無乳鏈球菌α相關蛋白重復結構缺失可能因丟失保護性抗原幫助細菌逃避宿主免疫，研究表明為在特定生存環境改變時α相關蛋白的多個重復序列發生自身變異，其中具有較長的α相關蛋白的菌株對人的致病性提高，說明α相關蛋白家族是與致病性相關的表面蛋白。本研究中發現3株細菌僅SAG-FX17號分離株為Alp1型，其他2株為未定型，說明可能有新的無乳鏈球菌菌株出現。

細菌增殖過程包括遲緩期、對數期和平臺期，影響細菌的毒性和致病力。該研究發現，臨床型乳腺炎奶牛乳汁和隱性乳腺炎奶牛乳汁的無乳鏈球菌分離株的體外培養增殖過程沒有明顯區別，說明細菌增殖不是影響3株細菌感染能力差異的主要原因。生物被膜是細菌黏附在基質表面，分泌多糖、纖維蛋白、核酸、脂質等，將自身包裹在其中形成大量細菌聚集膜樣結構[19]。免疫細胞所識別的細胞表面分子被生物被膜包裹，故不易被中性粒細胞、巨噬細胞等清除。細菌從游離態變為生物被膜態的過程中能夠促進炎癥反應，導致細胞死亡甚至引起組織壞死[20]。生物被膜可以作為細菌“菌巢”，在感染過程中隨時釋放游離態細菌，是造成乳腺炎慢性炎癥和復發性感染的重要原因。無乳鏈球菌強毒株在體外培養中形成生物被膜，但本研究發現3株細菌在體外培養基中培養時均不能形成生物被膜，但臨床型乳腺炎分離株SAG-FX17在體外與奶牛乳腺上皮細胞Mac-T共孵育時形成生物被膜的能力明顯增強，說明無乳鏈球菌在奶牛乳腺上皮細胞表面形成生物被膜可能增強細菌的感染能力。本研究還通過體外試驗研究3株無乳鏈球菌對Mac-T的黏附侵襲及在細胞內的存活能力，發現臨床型乳腺炎分離株SAG-FX17黏附能力明顯高于其他2株菌，該結果與生物被膜結果一致，細菌生物被膜的形成可能促進細菌對細胞的黏附能力，細菌在感染過程中形成生物被膜不僅能夠抵御抗生素、抗菌肽等殺菌物質，還可以增強細菌對奶牛上皮細胞的黏附能力，從而有利于更多的細菌侵襲到細胞內部[23]。研究發現，細菌黏附上皮細胞后發生細菌內化過程，細菌利用并激活宿主細胞信號通路引起細胞骨架重排進入非吞噬細胞內部[24]。乳房鏈球菌與停乳鏈球菌侵襲乳腺上皮細胞過程中發現網格蛋白的內化作用[25]。同時，細菌侵襲到細胞內部與黏附細胞能力并不是正相關，致奶牛乳腺炎大腸桿菌侵襲乳腺上皮細胞能力較低，但沙門氏菌侵襲能力很強[26]。本研究中3株細菌侵襲到細菌內部的能力很低，僅為黏附細菌數目的0.012%（SAG-FX17）、0.000 34%（CM31）、0.000 46%（CM41b），但黏附的細菌越多，侵襲到細胞內部的細菌越多。因此細菌在奶牛乳腺上皮細胞表面形成生物被膜，增強細菌對上皮細胞的黏附侵襲能力可能是影響無乳鏈球菌致病性的重要因素。

雖然3株無乳鏈球菌不易侵襲到細胞內部，但侵襲到細胞內的細菌均具有一定存活的能力。其中，隱性乳腺炎分離株CM31在胞內存活能力最弱，分離株CM41b在胞內存活能力最強，侵入細胞2 h后54%的細菌存活，3、4 h增長為88.4%、867%，說明該細菌在細胞內具有一定增殖能力，這可能是被該菌感染奶牛由隱性發展為臨床型乳腺炎的原因之一。LDH研究結果顯示，細菌與細胞互作的 6 h 內，細胞保持較好的活性，因此本試驗中只研究黏附后4 h內細菌在細胞內的存活能力。細菌能否長時間在上皮細胞中存活或通過上皮細胞進入到乳腺組織內部還需要進一步研究。細菌侵襲到細胞內部并且在其中存活具有重大意義，不僅與細菌致病性相關，還影響僅具有胞外活性的抗生素對細菌性乳腺炎的治療作用[27]。

綜上所述，具有代表性的3株無乳鏈球菌分別為臨床型乳腺炎奶牛乳汁分離株SAG-FX17、隱性乳腺炎奶牛乳汁分離株CM31和隱性轉臨床型乳腺炎奶牛乳汁分離株CM41b，其血清型均為Ⅰa型，具有2b型菌毛，CM31、CM41b未檢測到任何一種目標α相關蛋白基因，說明可能有新無乳鏈球菌菌株出現。分離株SAG-FX17可以在奶牛乳腺上皮細胞上形成生物被膜，增強了細菌黏附乳腺上皮細胞的能力，增強該菌致病性和對殺菌物質的抗性，可能是該分離株導致奶牛臨床型乳腺炎的主要原因。分離株CM41b在細胞內具有較高的存活能力，可能是該菌感染奶牛由隱性發展為臨床型乳腺炎的重要原因。因此，形成生物被膜和侵襲到細胞內部并存活對細菌性乳腺炎發展具有重要意義。本研究為進一步揭示無乳鏈球菌致奶牛乳腺炎的致病機制提供了理論依據，也為該病的預防和治療提供新的思路。

參考文獻：

[1]Gomes F，Henriques M. Control of bovine mastitis：old and recent therapeutic approaches. Current Microbiology，2016，72（4）：377-382.

[2]Hogeveen H，Steeneveld W，Wolf C A. Production diseases reduce the efficiency of dairy production：a review of the results，methods，and approaches regarding the economics of mastitis. Annual Review of Resource Economics，2019，11：289-312.

[3]侯瑞強.奶牛隱性乳腺炎及其防治. 當代畜牧，2018（20）：36-37.

[4]Lakew B T，Fayera T，Ali Y M. Risk factors for bovine mastitis with the isolation and identification of Streptococcus agalactiaefrom farms in and around Haramaya district，eastern Ethiopia. Tropical Animal Health and Production，2019，51（6）：1507-1513.

[5]Aitken S L，Corl C M，Sordillo L M. Immunopathology of mastitis：insights into disease recognition and resolution. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia，2011，16（4）：291-304.

[6]駱 巧，呂 倩，羅正中，等. 奶牛場無乳鏈球菌傳播途徑新發現. 中國奶牛，2020（4）：22-24.

[7]Shabayek S，Spellerberg B. Group B streptococcal colonization，molecular characteristics，and epidemiology. Frontiers in Microbiology，2018，9：437.

[8]Pietrocola G，Arciola C R，Rindi S，et al. Streptococcus agalactiae non-pilus，cell wall-anchored proteins：involvement in colonization and pathogenesis and potential as vaccine candidates. Frontiers in Immunology，2018，9：602.

[9]周明旭，左曉昕，徐 悅，等. 江蘇某牛場奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定、耐藥性及保守抗原分析. 揚州大學學報（農業與生命科學版），2019，40（6）：54-60.

[10]Reyes J，Chaffer M，Sanchez J，et al. Evaluation of the efficacy of intramuscular versus intramammary treatment of subclinical Streptococcus agalactiaemastitis in dairy cows in Colombia. Journal of Dairy Science，2015，98（8）：5294-5303.

[11]Imperi M，Pataracchia M，Alfarone G，et al. A multiplex PCR assay for the direct identification of the capsular type （Ⅰa to ⅠX） of Streptococcus agalactiae. Journal of Microbiological Methods，2010，80（2）：212-214.

[12]曾淑娟，趙文利，王 輝，等. 新生兒敗血癥無乳鏈球菌分型的研究. 中國婦幼保健，2015，30（34）：6028-6030.

[13]Lauer P，Rinaudo C D，Soriani M，et al. Genome analysis reveals pili in Group B Streptococcus. Science，2005，309（5731）：105.

[14]Moliveira I M，de Mattos M C，Pinto T A，et al. Genetic relatedness between group B streptococci originating from bovine mastitis and a human group B streptococcus type V cluster displaying an identical pulsed-field gel electrophoresis pattern. Clinical Microbiology and Infection，2006，12（9）：887-893.

[15]Kerro-Dego O，Prysliak T，Perez-Casal J，et al. Role of GapC in the pathogenesis of Staphylococcus aureus. Veterinary Microbiology，2012，156（3/4）：443-447.

[16]Radtke A，Bruheim T，Afset J E，et al. Multiple-locus variant-repeat assay （MLVA） is a useful tool for molecular epidemiologic analysis of Streptococcus agalactiaestrains causing bovine mastitis. Veterinary Microbiology，2012，157（3/4）：398-404.

[17]Shabayek S，Abdalla S，Abouzeid A M. Serotype and surface protein gene distribution of colonizing group B Streptococcusin women in Egypt. Epidemiology and Infection，2014，142（1）：208-210.

[18]Kong F，Gowan S，Martin D，et al. Molecular profiles of group B streptococcal surface protein antigen genes：relationship to molecular serotypes. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（2）：620-626.

[19]Silvestre I，Borrego M J，Jordo L. Biofilm formation by ST17 and ST19 strains of Streptococcus agalactiae. Research in Microbiology，2020，171（8）：311-318.

[20]Watters C，Fleming D，Bishop D，et al. Host responses to biofilm. Progress in Molecular Biology and Translational Science，2016，142：193-239.

[21]Melchior M B，Vaarkamp H，Fink-Gremmels J. Biofilms：a role in recurrent mastitis infections？. Veterinary Journal，2006，171（3）：398-407.

[22]Fan H J. Advances in pathogenesis of Streptococcus suisserotype 2. Journal of Integrative Agriculture，2017，16（12）：2834-2847.

[23]Ma F，Yi L，Yu N，et al. Streptococcus suisserotype 2 biofilms inhibit the formation of neutrophil extracellular traps. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2017，7：86.

[24]Calvinho L F，Oliver S P. Characterization of mechanisms involved in uptake of Streptococcus dysgalactiaeby bovine mammary epithelial cells. Veterinary Microbiology，1998，63（2/3/4）：261-274.

[25]Almeida R A，Matthews K R，Cifrian E，et al. Staphylococcus aureusinvasive of bovine mammary epithelial cells. Journal of Dairy Science，1996，79：1021-1026.

[26]Dpfer D，Almeida R A，Lam T J，et al. Adhesion and invasion of Escherichia colifrom single and recurrent clinical cases of bovine mastitis in vitro. Veterinary Microbiology，2000，74（4）：331-343.

[27]Kamaruzzaman N F，Chong S，Edmondson-Brown K M，et al. Bactericidal and anti-biofilm effects of polyhexamethylene biguanide in models of intracellular and biofilm of Staphylococcus aureusisolated from bovine mastitis. Frontiers in Microbiology，2017，8：1518.