生物散斑激光技術及在生鮮農產品品質控制中的應用

左映平 孫國勇

摘要：生物散斑激光技術與Fujii法、絕對值差法、慣性矩法、廣義差法等定性定量分析方法相結合，可用于判斷果蔬瘀傷、果蔬成熟過程生化變化、肉類品質、種子活力和果蔬真菌菌落感染程度等，該方法快速、簡便、經濟，可以保證生鮮農產品的質量和安全。對生物散斑激光技術的原理、計算方法、在生鮮農產品品質控制中的應用及面臨的挑戰進行綜述，以期為生物散斑激光技術在生鮮農產品品質控制中的應用實踐提供參考。

關鍵詞：生物散斑激光技術;果蔬保鮮;生鮮農產品;品質控制

中圖分類號： S123文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）05-0045-06

生鮮農產品包括生鮮果蔬及生鮮肉類，由于受到機械傷、呼吸作用或微生物污染等影響，生鮮果蔬在采摘、運輸和加工處理過程中非常容易變質，從而喪失貨架期[1]。若貯藏方式或加工方式不當，生鮮肉類的成熟反應和微生物生長就會加速，因此，對生鮮農產品從種植、養殖基地到餐桌期間的品質保障至關重要[2]。依據光學、超聲、電學和聲學特性原理，用于生鮮農產品無損檢測的光學檢測方法包括顯微鏡、激光散斑、功能化原子力顯微鏡、多普勒光譜、高光譜成像技術、振動光譜技術、圖像分析等。這些方法可用于生鮮農產品品質、內部缺陷、口感、含糖量等的檢測[3]，幾種適用于生鮮農產品的無損檢測方法見表1[4]。

生物散斑激光技術屬于光學檢測技術之一，近年來在生鮮農產品品質控制領域被廣泛研究，包括鑒定果蔬機械傷、成熟度和成熟變化、肉類成熟、種子活力、真菌菌落感染等，該技術也被用于評估黏彈性食品的光學和動態性能[5]。

1 生物散斑激光技術原理

生物散斑激光技術原理見圖1[6]，其主要設備是激光器、電荷耦合器件（CCD）相機、計算機等。首先，激光器發射激光照射生鮮農產品樣品的表面及內部，產生相干激光，由于受到背向散射光的干擾，在觀測平面上產生散斑圖。通過光的反射、透射等方式， CCD相機獲取到生物散斑圖像后傳輸到計算機中，經計算機內特定軟件進行分析，獲取生鮮農產品的生理生化信息。生鮮農產品樣本的散斑圖像一般有靜態圖像和動態圖像2種。靜態圖像是生物組織的固定粒子，動態圖像來自生物組織的粒子運動。其中，動態散斑圖案是生物材料的1個顯著特征，被稱為生物散斑，激光（波長在 600 nm 以上）可用于生物散斑儀的照明過程。

2 生物散斑圖像計算方法

利用Fujii法、加權廣義差（WGD）、廣義差（GD）法、慣性矩（IM）法和絕對值差（AVD）法可以建立激光輻照度與散斑活性的函數關系，對生物散斑活性進行分析。其中，AVD法、互相關法和IM法主要應用于定量分析，而Fujii法、時間差分法 （TD）、激光散斑時間對比分析（LASTCA）、激光散斑對比分析（LASCA）和廣義差法常被用于定性分析[6]。

2.1 Fujii方法

Fujii方法由Nohira、Yamamoto、Ikawa和Ohura于1987年提出，該方法最初用于測量血流量，目前被廣泛用于生物散斑分析。該方法基于計算連續圖像幀之間灰度絕對差的加權和，其中每個幀取加權平均值[7]。Fujii方法的計算公式如下：

F（x，y）=∑nK=1Ik（x，y）-Ik+1（x，y）Ik（x，x）+Ik+1（x，y）。（1）

式中：k是序列{1，…，N}的圖像索引;Ik是一個具有x、y坐標的像素的強度。

然而，Fujii法有一定的局限性，在描繪圖像的生物散斑活動的較暗區域時會產生假動作，糾正方法是利用小波變換完成頻率分解。

2.2 廣義差分法（GD）

廣義差分法是對Fujii法的補充[8]。廣義差分法去掉了加權步驟，特征是所有圖像之間像素強度差異的絕對估計值的累積總和，GD法計算公式如下：

GD（x，y）=∑N-1k=1∑Nl=k+1|Ik（x，y）-I1（x，y）|。（2）

式中：l、k為幀的下標;Ik為坐標（x，y）下像素的強度。

GD值是分組中每個像素強度的所有可能的生物散斑圖像集合之間對比度的總值，對排列中的第1個圖像輪廓和漸進圖像輪廓之間的相關性進行處理，并考慮中點。與Fujii法相比，活動圖上分析材料的圖像不太明顯。此外，GD計算是一種比較耗時的計算方法，這項技術的另一種變體是用平方值代替絕對值，此測量值表示為GD*[9]，其計算公式如下：

GD*（x，y）=∑N-1k=1∑Nl=k+12。（3）

與GD相比，GD*的生物斑點圖像顯示出更高的對比度。

而在加權廣義差分法（WGD）的計算中引入了1個附加的權值，其值隨時間序列的每次求和而變化[8]，以避免丟失瞬時數據。WGD計算公式如下：

WGD（x，y）=∑N-1k=1∑Nl=k+1|Ik（x，y）-Il（x，y）|Wp。（4）

式中：p=l-k，表示參考幀k的時間距離。隨著時間距離p改變，權重也改變，可以用來指示散斑強度的變化速度。GD、Fujii法可以解釋分析過程中散斑圖的完整活動，但未能描述活動的演變[10]。

2.3 時間序列散斑圖（THSP）

基于二維圖像時間序列散斑圖是一個由動態生物散斑的各種漸進圖片組成的矩陣。其中，行表示空間剖面，列表示在時間序列上的生物散斑圖像。THSP是通過使用從每張圖片中刪除的相似片段并將其放在一起而生成的。段按順序依次排列，THSP的寬度等于使用的圖片數，表示生物散斑的時間尺度。THSP圖像利用共同事件矩陣IM將每個THSP像素的變化量與鄰近變化量聯系起來[11]。THSP的計算公式如下：

ξ=1N-1∑N-1t=1（μt，t+1-μt）2μt。（5）

2.4 絕對值差（AVD）

絕對值差是一階統計矩，可以代替慣性矩法[12]。在某些情況下，AVD法表現出更好的生物散斑活性分析，特別是當THSP矩陣不包含高頻數據時。AVD的計算公式如下：

AVD=∑ij{COM×|i-j|}。（6）

2.5 激光散斑時間對比分析（LASTCA）

LASTCA技術依賴于空間或時間對比度的估計，確定時間序列中每個幀像素的平均值和標準差的比值。動態散斑的序列特征可以用來揭示暗的次表層項[13]。LASTCA的計算公式如下：

Kt（x，y）=1N-1{∑Nn=12}Ixyt。（7）

2.6 激光散斑對比度分析（LASCA）

激光散斑對比度分析是一種在線處理技術，它通過檢測顆粒模糊程度，使用1幅圖像來分析樣品的活性，是一種快速、經濟的在線檢測方法。LASCA的計算公式如下：

Kx=σxIx。（8）

2.7 運動歷史圖像（MHI）

運動歷史圖像法能夠及時識別1組運動中的圖像，可以作為一種可行的在線工具被用于動態散斑分析中[14]。MHI通過給每個像素（x，y）分配1個時間標記（ms、s、min、h）來形成最終圖像，如果在規定的時間段后保持靜止，則圖像將被移除。在MHI圖中，較高密度的點表示高活性區域，而較小密度的點表示低活性區域[15]。在檢查有機和無機樣品時，MHI與LASCA均有良好的結果。此外，MHI還提供與GD和Fujii類似的離線檢測數據輸出。MHI法的計算公式如下：

MHI（x，y）=∑nJ=1TjKj。（9）

2.8 慣性矩（IM）

慣性矩是一種常用的數值計算方法，基于THSP矩陣建立，是作為中間圖像的共現矩陣（COM）[16]，此二階矩稱為矩陣的慣性矩。該方法由Arizaga等通過模擬創建，得到97%～98%范圍內的可靠結果[8]。IM法公式：

IM=∑ijMij（i-j）2。（10）

3 生物散斑激光技術在生鮮農產品中的應用

3.1 檢測園藝產品的機械損傷

新鮮農產品遭受機械損傷后，游離水被排出，酚類化合物氧化，導致受損組織褐變，最終導致農產品質量下降。果蔬組織受到損害后，生物活性也隨之改變，且生物活性的變化可以被繪制成圖[17]，應用生物散斑法可以檢測出果蔬表面、內部的損傷。

Passoni等將生物散斑激光技術與GD法、Fujii法和LASTCA法相結合，識別并分析蘋果的機械傷，發現慣性矩法在蘋果新鮮區和損傷區的生物散斑活性差異最大，而灰色共生矩陣（GLCM）、BA值2個參數更有利于區分蘋果的新鮮度和損傷;蘋果在受到撞擊后，受損區的生物散斑活性減弱，初步建立了圖像參數與蘋果內部品質指標（硬度和可溶性固形物含量）的擬合模型（R2≥0.8）。Samuel等將動態激光散斑成像系統與交叉處理法、時間序列散斑圖結合并用其評估橙子、芒果、蘋果、番石榴和黃瓜的性質[24]。Retheesh等通過研究證實，運動歷史圖（MHI）作為一種有效的在線損傷檢測工具，可被用于分析綠橙果實疤痕[15]。劉家瑋等利用 He-Ne 激光照射無損棗和損傷棗表面發現，隨著貯藏時間的變化，棗的生物散斑活性有較大變化，且無損棗與損傷棗的變化趨勢不同[25]。劉海彬等通過比較Fujii法和加權廣義差分法（WGD法）區分皇冠梨缺陷（腐爛）部位及完好部位（花萼/果梗，無缺陷部位）的效果，發現WGD法識別缺陷的效果好，建模和預測準確率均達到97.5%。

3.2 生鮮農產品成熟度的檢測

3.2.1 肉類成熟的檢測 結合慣性矩和絕對差的生物散斑法是分析、量化肉成熟過程中生物活性變化的有效工具，尤其是在牛肉品質的評價方面。利用激光生物散斑技術可以檢測牛肉成熟過程中的生物變化[28]，灰度模板匹配法、小波變換融合、對比度調制融合法可以對牛肉硬度及咀嚼性進行預測，此外，生物散斑技術還可用于牛肉摻腐檢測[31]，也可用于豬肉、雞肉的品質評價。

3.2.2 果蔬成熟度的檢測 將生物散斑激光技術與THSP圖像、慣性矩相結合，可用于獼猴桃、梨、蘋果、番茄、檸檬、甘蔗、芒果等果蔬的成熟度檢測。生物散斑活性分析結果表明，獼猴桃過熟果實和優質果實間存在顯著差異[34]，梨比蘋果、番茄具有更高的生物散斑活性，隨著農產品成熟，生物散斑作用減弱[35]，檸檬的動態散斑測量值隨著果實品質的下降而變化[36]。此外，芒果、番茄、甘蔗的成熟度也被研究。

3.3 微生物污染檢測

生物散斑激光技術可以檢測微生物的生長進程，是快速確定食品中病原體感染的有效方法，因此可用于污染檢測。目前，生物散斑激光技術已被用于分析銅綠假單胞菌[41]、大腸桿菌[42]、念珠菌病[43]、黃曲霉[44]、尖孢鐮刀菌[45]等真菌感染情況。

3.4 生化過程

生物散斑活性可以反映生鮮農產品的生物活性。在果實成熟的過程中，細胞器運動、細胞質流動、細胞生長和分裂等過程以及細胞內發生的生化反應是引起生物散斑活性變化的主要原因。生物散斑活性測定可作為確定水果組織細胞內新陳代謝和生化變化的方法。生物散斑活性隨著溫度下降而降低的特征可用Q10系數來衡量[46]。在蘋果采前階段，生物散斑活性增強，可溶性固形物含量增加，有機酸、淀粉含量略有下降[47]，蘋果中葉綠素含量與生物散斑活性呈線性相關，葉綠素含量的增加會導致生物散斑活性呈線性下降。

將激光散斑對比分析法（LASCA）、廣義差分法（GD）、Fujii法、時間對比法（TC）、轉動慣量法（IM）與生物散斑激光技術相結合，可用于檢測種子的活性、含水量等參量，是一種在農業和生物醫學領域能發揮重要作用的新型檢測手段[48]。門森利用紅外熱成像技術和激光散斑技術，提出基于多參數信息融合的豌豆種子和栓皮櫟種子活力檢測方法，準確率分別可達95.33%和94.67%[49]。Sutton等研究發現，利用生物散斑激光分析技術可以有效地識別發芽受損核，可用于控制小麥種子萌發和休眠過程[50]。此外，生物散斑激光技術也被應用在馬鈴薯、玉米種子活力檢測中。

4 生物散斑激光技術的挑戰

目前，生物散斑激光技術的推廣應用障礙主要包括2個方面：一是缺乏相關技術標準。用于生物散斑圖像分析的計算公式、方法較多，但相關方法的比較和優劣性大多尚未被研究清楚，計算方法不同，輸出的圖形或數值也不同。為了收集和標準化這些方法，Braga開發了1個開放數據庫，該數據庫可免費訪問生物散斑激光技術的大量原始數據[56]，但標準方法的制訂仍然大大限制了生物激光散斑技術在生鮮農產品中的應用。二是缺乏用于測量生鮮農產品散斑活性的儀器設備。例如，氦氖激光最大的局限性在于難以從光學實驗室轉移到其他地方。生物散斑激光設備只有克服機械噪聲和外部光源的干擾，才能夠在室外使用。生物脈沖激光（波長為632.8 nm）對生物樣品的穿透較淺也限制了其應用。例如，蘋果皮穿透深度僅為2 mm左右，僅可從皮下組織獲得生物脈沖信息，很難獲得果實中心的生物脈沖活性[57]。

5 結論

生物散斑活性是基于生鮮農產品內部生物物質及其細胞內生化變化過程（如細胞器運動、細胞質流動、細胞生長和分裂）中生物散斑活性進行分析的，獲得有意義的結果并對其進行解釋。在定量分析中，常采用絕對值差（AVD）、互相關和慣性矩（IM）等方法。定性方法常采用Fujii法、時差法（TD）、激光散斑對比分析法（LASCA）、激光散斑時間對比分析法（LASTCA）和廣義差分法（GD），生物脈沖方法具有非破壞、簡單、低成本等特點，在醫學、微生物學和農業等領域有廣泛的應用，包括監測新鮮農產品的成熟度和成熟過程及檢測病害和缺陷等。

目前，生物散斑激光技術因一些技術難題尚未完全解決而無法實現工業化應用，如噪聲干擾、制訂標準化程序等，這些都需要進一步研究。另外，生物散斑激光技術在水果可食性涂膜厚度測量、農產品表面微生物種群鑒定及水果褐變、果實成熟度和種子活力測定等方面的應用仍有待進一步研究。

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