NCX1通過介導鈣離子內流損傷足細胞的機制研究

崔少遠，傅 博，王 旭，陳香美

解放軍總醫院第一醫學中心 腎臟病科，腎臟疾病國家重點實驗室，北京 100853

蛋白尿是原發性腎小球疾病基本的臨床表現，也是慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)進展的獨立危險因素，其通過改變腎小球血流動力學、損傷腎小球毛細血管壁及系膜細胞等造成腎小球硬化，大量蛋白尿的持續存使腎損傷進行性加重，最終導致終末期腎病[1]。降低蛋白尿是治療腎病的關鍵，對早期防治CKD具有重要意義。

目前認為蛋白尿發生的主要原因是腎小球濾過屏障結構和功能改變，腎小球濾過屏障主要由足細胞及足細胞足突裂隙膜(slit diaphragm，SD)組成，足突附著在腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)的腎小球毛細血管上，形成細胞間連接，從而產生隔膜濾過屏障，幫助維持正常腎功能[2]；足細胞損傷后足突消失、細胞凋亡，導致腎小球濾過屏障破壞，是局灶節段性腎小球硬化、微小病變腎病以及糖尿病腎病等疾病患者發生蛋白尿的關鍵因素[3]。足細胞結構蛋白Nephrin、NEPH1、P-cadherin、FAT、ephrin-B1、TRPC6等關鍵分子組成SD復合物，細胞骨架協同蛋白Synaptopodin、ZO-1、Podocin、CD2AP、MAGI等連接裂隙膜與細胞骨架，這些蛋白調節足細胞骨架維持足突的復雜結構，使其行使正常的濾過功能[4-5]。而在一些有害因素的刺激下，足細胞內鈣離子濃度可持續性升高，即鈣超載，鈣超載會對足細胞產生不可逆損傷，使足細胞凋亡、分離，足突結構改變及數量減少，破壞腎小球結構動態平衡，改變腎小球濾過系數，導致蛋白尿的發生[6]。

Ca2+是機體各項生理活動不可缺少的離子，作為第二信使參與多條信號通路轉導發揮重要作用，維持胞內鈣穩態主要指維持內質網鈣庫、質膜鈣泵及鈣離子通道的鈣穩態[7]。NCX1作為調控Ca2+的重要通道，是廣泛分布于膜結構(如細胞質膜、線粒體膜、內質網膜等)的陽離子轉運蛋白，功能上具有兩種轉運模式：介導Na+內流、Ca2+外排的前向模式(forward mode)和作用相反的反向模式(reverse mode)[8]。在有害因素刺激下，NCX1反向模式的異常激活導致胞內Ca2+濃度持續升高，形成鈣超載，啟動下游鈣離子信號通路，導致病理反應[9-10]。

本研究建立被動型海曼腎炎(passive Heymann nephritis，PHN)大鼠模型，探討鈉鈣交換蛋白1(sodium-calcium exchanger 1，NCX1)與蛋白尿的關系；體外培養足細胞，建立補體激活足細胞損傷模型，檢測胞內Ca2+變化及下游信號通路的激活情況，觀察足細胞骨架蛋白及相關蛋白的表達，NCX1反向作用抑制劑KB-R7943能否有效減輕足細胞損傷，闡明NCX1在足細胞損傷中的重要 作用和可能機制。

材料和方法

1 實驗材料 SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，于解放軍總醫院第一醫學中心SPF級屏障實驗動物中心飼養；小鼠足細胞條件永生系MPC-5為美國Bronx大學的Dr. Peter Mundel惠贈；Ca2+探針Fluo-3、F-actin探針購自Thermo Scientific公司，NCX1、Nephrin、Synaptopodin抗體購自CST公司，RhoA、ROCK1、ROCK2抗體購自Abcam公司，體外毒理學檢測試劑盒、C6補體血清及不含C6的補體血清、KB-R7943購自S igma-Aldrich公司。

2 建立PHN大鼠模型 近曲腎小管刷狀緣抗原Fx1A提取：200 ～ 250 g雄性SPF級SD大鼠25只，3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，取腹正中切口，心臟取血后左心室注入0.9%氯化鈉注射液灌洗腎致腎變白，取下腎，低溫下分離腎皮質。取無血的腎皮質加入甘露醇-Tris-HCl緩沖液(10 mL/g腎皮質)，玻璃勻漿器制勻，腎皮質勻漿，加入1 mol/L MgCl2至濃度為10 mmol/L，攪拌15 min，2 200 g離心20 min，取上清，100 000 g 4℃離心45 min，收集沉淀，冷凍干燥，?20℃保存，近曲腎小管刷狀緣抗原Fx1A提取已完成。兔抗大鼠Fx1A抗血清制備：雄性新西蘭大白兔4只，體質量約2.5 kg，通過足趾一腘窩淋巴結一背部皮內皮下多點注射混合免疫法免疫兔子，末次注射免疫原后10 d試血。從耳靜脈采血檢測效價達1︰32 000以上時，頸動脈插管放血，分離Fx1A抗血清。使用前56℃滅活補體30 min，大鼠血球吸附，抗血清小量分裝，?20℃保存；雄性Wistar大鼠30只，隨機分為兩組，一組經腹腔一次性注射蒸餾水，劑量為0.8 mL/100g，另外一組經腹腔一次性注射等量兔抗Fx1A抗血清。于第1周末開始測定大鼠24 h尿蛋白定量，金屬代謝籠收集24 h尿液，全自動生化分析儀測定尿蛋白，當24 h尿蛋白定量＞1 0 mg時認為模型建立成功。

3 建立體外補體激活足細胞損傷模型 對照組(Con組)：小鼠足細胞MPC-5用含Rabbit anti-Fx1A抗體5 mg/mL的無血清培養液37℃孵育30 min，孵育后用不含C6補體的血清37℃孵育60 min。補體激活足細胞損傷模型組(C5b-9組)：小鼠足細胞MPC-5用含Rabbit anti-Fx1A 抗體5 mg/mL的無血清培養液37℃孵育30 min，然后用含C6補體的亞溶解劑量的補體血清(稀釋度為8%)的細胞培養液37℃孵育60 min。Checkerboard titration studies 法確定細胞亞溶解劑量，體外毒理學檢測試劑盒(Sigma-Aldrich)測定細胞培養上清液中乳酸脫氫酶的含量確定造模成功。NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理組(KB-R7943組)：5μmol/L KB-R7943預處理足細胞24 h，含Rabbit anti-Fx1A抗體5 mg/mL的無血清培養液37℃孵育30 min，然后用含亞溶解劑量的補體血清(稀釋度為8%)的細 胞培養液37℃孵育60 min。

4 胞 內Ca2+檢 測 Ca2+探 針Fluo-3 5 μmol/L 37℃避光孵育細胞30 min，PBS洗滌3次，激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)上機觀察，掃描圖 像，數據分析。

5 免疫熒光檢測 標本置于預冷的4% 多聚甲醛，4℃ 固定20 min，PBS洗滌3次；0.1%的TritonX-100 4℃透化20 min，PBS洗滌3次；5%BSA室溫封閉20 min，加入一抗4℃孵育過夜；洗滌，加入二抗，室溫1 h。激光共聚焦顯微鏡( Olympus FV1000)上機觀察，掃描圖像。

6 Western blot檢測 裂解標本，提取蛋白，變性，電泳分離目標蛋白，轉膜，一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌；二抗室溫孵育1 h。化學發光儀(美國UVP)檢測，拍攝圖像，灰度分析軟件Q uantity One計算灰度值，統計分析。

7 統計學方法 采用Graphpad Prism 7軟件進行圖表制作及統計分析。觀測數據均為計量資料，以 xˉ ±s表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意 義。

結 果

1 PHN大鼠模型中NCX1表達水平的變化 免疫熒光染色結果顯示，與對照組比較，PHN模型組大鼠NCX1的表達水平隨造模時間逐漸減少，并 在21 d時達到最低(圖1)。

2 補體激活足細胞損傷模型中NCX1及Ca2+水平的改變 NCX1熒光染色結果顯示，在補體激活足細胞損傷模型組中其表達降低，應用反向模式抑制劑KB-R7943處理后，其表達明顯增高(圖2A)。Ca2+熒光染色結果顯示，與對照組相比，補體激活足細胞損傷模型組的胞內Ca2+濃度明顯升高(P＜0.05)；應用NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理后，胞內Ca2+濃度明顯降低(P＜0.05)(圖2 B和圖2C)。

3 足細胞損傷模型中Ca2+下游RhoA/ROCK信號通路分子活性的改變 我們進一步用Western blot分析了補體激活足細胞損傷模型中Ca2+下游RhoA/ROCK信號通路分子活性與表達的改變。結果顯示，與對照組比較，補體激活足細胞損傷模型中活化型RhoA (active RhoA)、ROCK1和ROCK2蛋白的表達水平明顯增高(P＜0.05)；應用NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理后，可以有效降低這些信號通路蛋白的活性及表達水平(P＜0.05)，提示抑制NCX1反向模式可以有效降低RhoA/ROCK信 號通路的激活(圖3)。

圖 1 免疫熒光染色檢測PHN大鼠模型中NCX1的表達(Con組：對照組；PHN模型組7 d、14 d、21 d、28 d；藍色：細胞核)Fig.1 Expression of NCX1 in PHN rat model detected by immunofluorescence staining (Con: control group; PHN model groups for 7 days, 14 days, 21 days, 28 days; Blue: nuclei)

4 NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理有效減輕足細胞損傷 應用激光共聚焦顯微鏡觀察足細胞中細胞骨架蛋白F-actin的表達與結構改變。結果發現對照組細胞骨架沿細胞長軸呈線性分布，骨架結構整齊清晰，足突明顯，熒光強度明亮；補體激活足細胞損傷模型組骨架蛋白表達較對照組降低，足細胞皺縮，骨架結構斷裂，排列紊亂；而KB-R7943處理組骨架蛋白表達水平恢復，細胞骨架結構明顯改善，足細胞損傷明顯減輕(P＜0.05)。足細胞標志物Nephrin蛋白主要在細胞質中表達，呈顆粒或線裝分布。F-actin、Nephrin蛋白、足細胞骨架協同蛋白Synaptopodin在三組間的變換趨勢比較一致，補體激活足細胞損傷模型組顯著低于對照組(P＜0.05)；而KB-R7943處理組顯著高于補體激活足細胞損傷模型組(P＜0.05)，而與對照組比較則無統計學差異(圖4)，說明足細胞損傷后三種蛋白表達均降低，而KBR7943可以逆轉這種損傷，使蛋白水平恢復到正常水 平。

圖 2 補體激活足細胞損傷模型中NCX1及Ca2+水平的變化(藍色：細胞核)A：足細胞免疫熒光染色NCX1；B和C：足細胞Ca2+熒光染色圖像及熒光數據分析；Con：對照組；C5b-9：補體激活足細胞損傷模型組；KB-R7943：NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理組(n=10，C5b-9 vs Con，KB-R7943 vs C5b-9，aP＜0.05)Fig.2 Immunofluorescence staining of NCX1 and intracellular Ca2+ in podocytes (Blue: nuclei)A: Immunofluorescence staining of NCX1; B and C: Fluorescence imaging and quantitative analysis of Ca2+; Con: Control group; C5b-9: Complement injured podocyte model group; KB-R7943: KB-R7943 treatment group (n=10, C5b-9 vs Con, KB-R7943 vs C5b-9,aP＜0.05)

圖 3 Western blot檢測RhoA/ROCK信號通路蛋白活性Con：對照組；C5b-9：補體激活足細胞損傷模型組；KB-R7943：NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理組(n=5，C5b-9 vs Con，KBR7943 vs C5b-9，aP＜0.05)Fig.3 RhoA/ROCK signaling pathway proteins activities detected by Western blot Con: Control group; C5b-9: Complement injured podocyte model group; KB-R7943: KB-R7943 treatment group (n=5, C5b-9 vs Con,KB-R7943 vs C5b-9, aP＜0.05)

討 論

哺乳動物的NCX是由同源蛋白的多基因家族形成，包括3個家族、9個亞型，分別為非K+依賴性的NCX1、NCX2、NCX3；K+依 賴性的NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5；陽離子依賴性的NCKX6和NCLX[11]。NCX1廣泛分布于哺乳動物器官和組織，NCX2和NCX3主要表達于神經和骨骼肌中，而腎表達以NCX1為主[12]。近年來，各領域對NCX1的研究不斷深入，NCX1不僅能夠調控Ca2+濃度，還參與調節細胞興奮性及興奮耦聯功能[13-15]，參與細胞生長、分化、凋亡、浸潤、遷移等過程[16-18]。在心臟搏動、大腦長程學習效應、血壓控制、腎重吸收、免疫應答、神經遞質傳遞、胰島素分泌等方面發揮重要作用。?

圖 4 足細胞F-actin、Nephrin和Synaptopodin的表達與結構改變(藍色：細胞核 )A：免疫熒光染色檢測F-actin、Nephrin和Synaptopodin；B：熒光數據分析；Con：對照組；C5b-9：補體激活足細胞損傷模型組；KBR7943組：NCX1反向模式抑制劑KB-R7943處理組(n=12，C5b-9 vs Con，KB-R7943 vs C5b-9，aP＜0.05)Fig.4 Immunofluorescence staining of F-actin, Nephrin and Synaptopodin in podocytes (Blue: nuclei)A: Immunofluorescence imaging of F-actin, Nephrin and Synaptopodin; B: Quantitative analysis of immunofluorescence images; Con:Control group; C5b-9:Complement injured podocyte model group; KB-R7943: KB-R7943 treatment group (n=12, C5b-9 vs Con, KBR7943 vs C5b-9, aP＜0.05)

有報道NCX1參與腎Ca2+重吸收，與腎缺血再灌注相關，并誘導腎上皮細胞轉分化[19-20]。關于NCX1在腎小球足細胞中作用的研究較少，已報道腎小球足細胞中有NCX1表達；在嘌呤霉素誘導的足細胞損傷研究中發現NCX1表達減少，其前向模式受到抑制而激活反向模式，增加了Ca2+內流導致胞內Ca2+超載，損傷足細胞[21]。NCX1作為調節胞內Ca2+的重要通道，在調節細胞骨架方面發揮重要作用，其調節細胞骨架的作用依賴自身Ca2+結合中心的變構激活，與胞內Ca2+濃度密切相關[22]。我們的工作證實了NCX1通過調控鈣離子內流激活了RhoA/ROCK信號通路，從而改變足細胞骨架結構，導致足細胞損傷，應用KB-R7943能有效減輕足細胞損傷。KBR7943屬于Benzyloxyphenyl衍生物，NCX反向轉運的選擇性抑制劑，其廣泛應用于心血管相關疾病的研究[23]。KB-R7943可濃度依賴性地舒張高鉀預收縮的大鼠離體腎動脈環，為治療腎性高血壓，緩解腎病理損傷提供實驗依據[24]；KBR7943對缺血再灌注所致的腎功能障礙和組織損傷有保護作用[25-26]；本研究證實了其在足細胞中的保護作用，這些研究證實了KB-R7943在腎病治療中的可能性。

NCX1作為膜蛋白，其在細胞表面不規則分布，胞內呈弱放射線分布，與F-actin張力纖維接觸，而且在細胞與細胞連接的區域呈現高表達，同時F-actin亦高表達，這與相鄰足細胞連接形成腎小球濾過屏障，調控腎小球濾過的作用極其相似；而足細胞中另外一個重要的Ca2+通道蛋白TRPC6是腎小球裂隙膜蛋白SD復合物分子，其與NCX1的復合物能調控細胞遷移，這對維持腎小球濾過作用很重要，NCX1是否也是SD復合物分子？其與已知的組成裂隙膜的重要結構蛋白質CD2AP、Podocin等存在何種相互作用？這是我們進一步研究的方向，以全面揭示NCX1在足細胞上的作用機制，探索蛋白尿產生的新途徑，為臨床防治蛋白尿提供新的思路。