夾竹桃麻素對兔心房肌細胞氧化應激損傷L型鈣電流及動作電位時程的影響

劉 巖，李 泱，葉加虎，劉 昕，王延坤，單兆亮

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院 京北醫療區，北京 100091；3 解放軍總醫院第一醫學中心 心內科，北京 100853

近年來，心房顫動(房顫)的全球患病率及其相關死亡率顯著上升，社會負擔逐年增加，影響著公共健康[1-3]。房顫的發生、發展機制復雜，大量研究表明氧化應激與房顫關系密切[4-6]。夾竹桃麻素(apocynin，APO)是氧化應激損傷過程中重要的氧化酶抑制劑，其能夠對抗氧化應激的損傷作用[7-8]。本課題組以往研究表明，APO對兔心房肌細胞瞬時外向鉀電流及超速激活延遲整流鉀電流氧化應激損傷具有保護作用[9]。但APO對L型鈣電流(L-type calcium current，ICa,L) 和動作電位時程(action potential duration，APD)的氧化應激損傷是否有保護作用未見報道。因此，我們運用了膜片鉗技術，研究APO對ICa,L和APD氧化應激損傷的保護作用。

材料和方法

1 實驗動物 從解放軍總醫院實驗動物中心購買新西蘭白兔15只，體質量1.0～1.5 kg，雌雄不限。本實驗經解放軍總醫院動物實驗倫理委員會批 準(編號：20110010703)。

2 試劑 夾竹桃麻素、CaCl2、胰蛋白酶、CdCl2、膠原酶Ⅱ購自Sigma公司。其他為國產試劑。臺式液：葡萄糖10 mmol/L，MgCl21.0 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，NaCl 135 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，NaOH調整pH值至7.4[9]。酶液：胰蛋白酶12 mg，Ⅱ型膠原酶70 mg，無鈣臺式液50 mL[9]。反轉錄及qPCR試劑(北京TransGen公司)，抗CACNA1C小鼠單克隆抗體(ab84814) (Abcam公司，英國)，抗GAPDH小鼠單克隆抗體(TA-08)，其 他試劑均為分析純。

3 兔單個左心房肌細胞的分離 按文獻[10-12]方法并加以改進制備兔單個左心房肌細胞。術前配制麻藥水合氯醛(200 g/L)。經腹腔注射(2 mL/kg)麻藥，徹底麻醉后從胸部剪開快速取心臟，隨后在Langendorff裝置上灌流。首先用無鈣臺式液灌流3～5 min，隨后再用酶液灌流20～25 min。灌流過程中維持37℃并通100%純氧。灌流完畢后將左心房組織剪碎入KB液中，同時邊剪邊吹打。最后將分離細胞保存于4℃ KB液中，靜止1 h后實 驗。

4 分組及處理 將兔左心房肌細胞共分為5組：1)對照組：不做處理，直接實驗；2)10 μmol/L H2O2組：10 μmol/L的H2O2培養30 min后實驗；3)50 μmol/L H2O2組：50 μmol/L的H2O2培 養30 min后實驗；4)50 μmol/L H2O2+ 100 μmol/L APO組：100 μmol/L APO培養60 min，再50 μmol/L H2O2培養30 min后實驗；5)APO組：100 μmol/L A PO培養90 min后實驗。

5 膜片鉗全細胞L型鈣電流及動作電位記錄 挑選無收縮、狀態良好、橫紋清晰的細胞進行實驗。高阻(＞1 GΩ)封接破膜后，行全細胞記錄。離子電流信號經AXON-700B膜片鉗放大器、軟件(pCLAMP)控制采集、貯存及分析。電壓鉗模式 行電流記錄。電流鉗模式行動作電位記錄。

6 RT-qPCR法 檢 測 肌 細 胞L型 鈣 離 子 通道CACNA1C mRNA的表達水平 每組細胞分別處理后，應用Trizol試劑一步法行心房肌總RNA提取。應用兩步法行RT-qPCR反應。CACNA1C上游引物5′-GATGCAAGACGCTATGGGCTATGAG-3′，下游引物5′-GCATGCTCATGTTTCGGGGTTT GTC-3′均由上海捷瑞公司設計與合成。NanoDrop 2000評估各樣本的質量，A260/A280在1.8～2.1，A260/A230＞1.8為合格。各樣本上樣1 μg，隨機反轉錄為cDNA。以對照組第一個樣本為參照樣本，采用 2?ΔΔCt法評估各組相對表達數值。實驗重復3次。

7 Western blot檢測肌細胞CaV1.2蛋白的表達水平 將以上5組細胞經預冷的PBS兩次漂洗后，用細胞裂解液(含蛋白酶抑制劑)于準備好的冰塊上裂解30 min；12 000 g離心15 min，行上清液收集；用BCA法測定濃度后，高溫使蛋白變性，加樣，用5%濃縮膠和8%分離膠跑膠，行濕轉法轉膜。抗鼠抗兔CaV1.2單克隆抗體以1∶1 000稀釋，CaVβ2以1∶1 000稀釋，4℃孵育后過夜，TBST洗膜5 min×3次，Ⅱ抗孵育1.5 h后行3次洗膜，ECL法顯色。行半定量分析(應用Image J圖像分析軟件)。用目的蛋白和GAPDH條帶光密度 值的比值表示蛋白質的相對含量。

8 統計學處理 使用SPSS23.0進行研究資料分析。觀測資料均為計量數據，均通過正態性檢驗，以±s 表示。兩組間的比較為成組t檢驗或校正t檢驗。多組間的比較為單因素方差分析+兩兩比 較LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

結 果

1 APO對兔單個左心房肌細胞ICa,L的作用 10 μmol/L H2O2組：ICa,L峰值從(?18.5±0.1) pA/pF減至(?10.7±0.7) pA/pF (P＜0.01，n=13)；50 μmol/L H2O2組：ICa,L峰 值 從(?18.5±0.1) pA/pF減 至(?9.4±0.8) pA/pF (P＜0.01，n=13)；50 μmol/L H2O2+100 μmol/L APO組：ICa,L峰值為(?16.7±1.6) pA/pF，與50 μmol/L H2O2組比較差異有統計學意義(P＜0.01，n=13)；100 μmol/L APO組：ICa,L峰值為(?17.2±1.3) pA/pF，與對照組比較無統計學差異 。見圖1。

2 APO對ICa,L電流-電壓曲線的作用 在0 mV時電流達峰值，電流-電壓呈現出“倒鐘”型曲線。在H2O2作用下，電流明顯被抑制，電流-電壓接近“三角”型曲線。預先給予100 μmol/L APO后，電 流抑制得到恢復。見圖2。

3 APO對ICa,L穩態激活和穩態失活曲線的作用 在H2O2作用下，激活曲線正移。H2O2(10 μmol/L)組：半激活電壓(V1/2,act)由(?37.5±0.6) mV正移至(?29.3±0.4) mV (P＜0.05)；H2O2(50 μmol/L)組：半激活電壓(V1/2,act)由(?37.5±0.6) mV正移至(?20.3±0.5) mV (P＜0.01)；H2O2(50 μmol/L)+APO (100 μmol/L)組：V1/2,act恢復至(?29.8±0.3) mV(與50 μmol/L H2O2組比較差異有統計學意義，P＜0.05)。提示APO可能通過增加通道穩態激活來減少H2O2對ICa,L電流的影響，各組曲線斜率(k)改變較小(圖3A)。在H2O2作用下，失活曲線負移。H2O2(10 μmol/L)組：半失活電壓(V1/2,act)由(?19.2±0.7) mV負移至(?25.5±0.8) mV (P＜0.05)；H2O2(50 μmol/L)組：半激活電壓(V1/2,act)由(?19.2±0.7) mV負 移 至(?29.3±0.4) mV (P＜0.01)；H2O2(50 μmol/L)+APO (100 μmol/L)組：V1/2,act恢復至(?25.9±0.7) mV (與50 μmol/L H2O2組比較差異有統計學意義，P＜0.05)。提示APO可能通過減緩通道穩態失活過程來減少H2O2對ICa,L電流的影響，各 組曲線斜率(k)改變較小(圖3B)。

圖 1 APO對心房肌細胞ICa,L的作用(n=13)A：ICa,L電流圖；B：ICa,L最大峰值電流的對比；aP＜0.01，vs對照組；bP＜0.01，vs 50 μmol/L H2O2處理組Fig.1 Effect of APO on ICa,Lof atrial myocyte (n=13)A: current of ICa,L; B: contrast of the peak current of ICa,L; aP＜0.01, vs control group; bP＜0.01, vs 50 μmol/L H2O2

圖 2 APO對ICa,L的電流-電壓曲線的作用(n=13)F ig.2 Effect of APO on the I-V curve of ICa,L (n=13)

4 APO對ICa,L失活后恢復動力學的作用 各組通道電流失活后，通道恢復曲線基本保持一致。見 圖4。

5 APO對動作電位的作用 在H2O2作用下，動作電位形狀發生變化，RMP絕對值降低，APD縮短，APD50及APD90均降低(與對照組差異有統計學意義，P＜0.05)。應用100 μmol/L APO后上述降低得到顯著恢復，APD50與H2O2處理組比較差異 有統計學意義(P＜0.05，n=13)。見圖5，表1。

圖 3 APO對ICa,L穩態激活和穩態失活曲線的作用(n=13)Fig.3 Effect of APO on steady-state activation and steady-state inactivation curve of ICa,L (n=13)

圖 4 APO對ICa,L失活后恢復動力學的作用(n=13)F ig.4 Effect of APO on the recovery from inactivation of ICa,L (n=13)

圖 5 APO對APD的的作用F ig.5 Effect of APO on APD

6 qPCR法檢測H2O2對肌細胞CACNA1C mRNA表達的影響及APO的作用 圖6顯示，CACNA1C mRNA表達：對照組為1.102±0.050，H2O2組(10 μmol/L)為0.810±0.042，H2O2組(50 μmol/L)為0.790±0.035，APO(100 μmol/L)+ 50 μmol/L H2O2組為1.024±0.080，單純APO組為1.083±0.060。提示APO對H2O2處理后CACNA1C mRNA表達下 調有明顯的抑制效應(P＜0.05，n=13)。

7 Western blot 檢測兔左心房肌細胞CaV1. 2蛋白的表達 圖7顯示，H2O2處理后，可以使CaV1.2蛋白表達下調，而應用APO (100 μmol/L)后，此下 調得到恢復(P＜0.05，n=3)。

圖 6 APO對肌細胞CACNA1C mRNA表達的作用(aP＜0.05，vs對照組 ；bP＜0.05，vs 50 μmol/L H2O2組)Fig.6 Effect of APO on the expression of CACNA1C mRNA (aP＜0.05, vs control group；bP＜0.05, vs 50 μmol/L H2O2)

圖 7 Western blot 檢測兔左心房肌細胞CaV1.2蛋白的表達(aP＜0.05，vs 對照組；bP＜0.05，vs 50 μmol/L H2O2)Fig.7 Expression of CaV1.2 tested by Western blot (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs 50 μmol/L H2O2)

討 論

房顫是臨床上最常見的心律失常之一，其機制復雜，大量研究表明，氧化應激是誘發和維持房顫的重要機制之一[3,13]。本文用低濃度H2O2(10 μmol/L、50 μmol/L)創建氧化應激模型[14]，探討APO對左心房肌細胞是否具有保護作用。

表 1 H2O2與APO對體外兔左心房肌細胞AP各參數影響指標的比較 ( n =13,xˉ±s )Tab. 1 Comparison of the effect of H2O2 and APO on AP parameters ( n =13,xˉ±s )

APO抑制H2O2處理所致的兔左心房肌細胞ICa,L電流密度降低，分析其門控動力學機制：APO可能通過改變左心房肌細胞L型鈣通道的穩態激活曲線負向移動，增加通道的激活，與此同時使其穩態失活曲線正向移動，鈣通道的失活過程減緩，二者聯合，使同等電壓條件下，增加了鈣離子通道的開放數量，導致電流增加。前期研究表明，H2O2可使左心房肌細胞中谷胱甘肽的數量和超氧化物歧化酶的活性下降，并且可增加丙二醛的生成，APO使細胞內抗氧化酶含量增加，并且可以減弱對多不飽和脂肪酸的攻擊，從而降低氧化應激對左心房肌細胞的損傷[5]。

進一步研究顯示，APO可通過影響CACNA1C mRNA和CaV1.2通道蛋白的表達，來調節左房細胞鈣通道有效數量，從而影響ICa,L電流密度。提示我們APO不僅可以直接影響鈣通道門控動力學機制改變ICa,L，還可通過調節鈣通道基因及蛋白表達來改變ICa,L電流密度。眾所周知，L-鈣通道是構成心房肌動作電位復極的主要電流，尤其是對APD50的改變尤為重要[15-17]。本研究發現，APO通過增加ICa,L電流密度，可以延長APD，特別是APD50。這對于阻滯房顫的發生非常有利，也是減少房顫發生和維持的細胞電生理學基礎。

本研究僅局限于細胞水平，我們應進一步在整體動物水平進行探究，尤其需要觀察APO對氧化應激誘發房顫的體表心電圖及房顫發生率的影響。盡管如此，本研究對于揭示藥物心房肌細胞電生理和分子機制仍有一定意義。