血漿循環(huán)核酸應(yīng)用于肝細(xì)胞癌診斷與預(yù)后評價的初步探索

王 瑨，柳儼哲，陳 況，錢自亮，胡明根

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 肝膽外科，北京 100853

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一[1]。肝切除術(shù)仍然是HCC患者的重要治療選擇。遺憾的是肝癌患者接受根治性切除后的5年生存率約為50%，以往報道的5年復(fù)發(fā)率高達(dá)70% ～ 80%[2]。通過術(shù)后病理檢查確診的微血管浸潤(microvascular invasion，MVI)與腫瘤的病理進(jìn)展相關(guān)，是HCC患者預(yù)后不良的重要因素。如果能在術(shù)前預(yù)測MVI，可以為術(shù)式選擇以及藥物治療方案提供參考依據(jù)[3]。已有許多報道基于影像學(xué)和實驗室檢查結(jié)果建立預(yù)測術(shù)前MVI的模型[4]，其中影像學(xué)方法的主觀因素影響較大[5]，不利于普及，而現(xiàn)有的實驗室檢查普遍特異性不高[6]，因此沒有得到推廣。循環(huán)核酸(circulating free DNA，cfDNA)是指循環(huán)血中游離于細(xì)胞外的部分降解的機體內(nèi)源性DNA[7]。在腫瘤快速增殖過程中，死亡并裂解的腫瘤細(xì)胞會釋放出細(xì)胞內(nèi)的腫瘤基因組DNA片段，這些片段進(jìn)入人體的血液循環(huán)系統(tǒng)，被稱為循環(huán)游離腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)[8]。ctDNA由于來源于癌細(xì)胞，所以發(fā)生基因變異、缺失、畸形的概率大大增加，且ctDNA的變異程度與腫瘤亞型、腫瘤進(jìn)程相關(guān)。正因如此，腫瘤患者的cfDNA因為包含了ctDNA，呈現(xiàn)出高度的染色體不穩(wěn)定性[9]。目前已經(jīng)有研究表明cfDNA檢測可用于HCC的早期診斷，相對于甲胎蛋白有更高的特異性[10]。然而，cfDNA與HCC患者腫瘤進(jìn)程的相關(guān)性尚未見報道。本課題旨在研究術(shù)前cfDNA變異程度與肝癌患者M(jìn)VI風(fēng)險的關(guān)系，為HCC患者的治療方案評估提供新的參考。

資料和方法

1 研究對象 選取解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心肝膽外二科2019年3 - 10月收治的肝占位患者61例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)確診為肝占位；2)行根治性手術(shù)治療(肝切除術(shù)或射頻消融術(shù))；3)術(shù)后病理診斷為肝細(xì)胞肝癌、肝血管瘤、肝局灶性結(jié)節(jié)增生。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)肝占位非主要入院診斷；2)未進(jìn) 行根治性手術(shù)治療；3)年齡＜18歲或＞80歲；4)合并妊娠；5)嚴(yán)重合并發(fā)癥，包括終末期肺病，不穩(wěn)定型冠心病或充血性心力衰竭3 ～ 4級，慢性腎病4 ～ 5期，肝硬化(Child-Pugh)2 ～ 3級；6)免疫缺陷；7)數(shù)據(jù)記錄不完整。最終49例患者納入本研究。解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心倫理委員會批準(zhǔn)了本研究(倫審第S2018-250-01號)。所有 招募的受試者均簽署了書面知情同意書。

2 研究方法 收集患者基線資料(包括年齡、性別、身高、體質(zhì)量、入院時間、手術(shù)時間、出院時間、診斷和基礎(chǔ)疾病等)、術(shù)前實驗室檢查指標(biāo)(生化、腫瘤標(biāo)志物、乙肝五項，乙肝病毒DNA計數(shù)，CTC)、術(shù)后病理報告等。采集患者術(shù)前血樣，并對術(shù)后病理報告為肝細(xì)胞肝癌(43例)和良性病變(6例)的患者進(jìn)行血漿cfDNA提取、測序以及染色體不穩(wěn)定性分析。所有患者術(shù)后隨訪至2 020年7月30日。 。

3 微血管浸潤 微血管侵犯，也稱微血管癌栓，主要指肝癌組織在顯微鏡下于內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的血管腔內(nèi)見癌細(xì)胞巢團(tuán)。本研究MVI結(jié)果采集自患者術(shù)后的病理報告。M0為未發(fā)現(xiàn) MVI；M1為少于或等于5 個 MVI，且發(fā)生于近癌旁肝組織區(qū)域(≤1 cm)；M2為多于5 個 MVI，或 MVI 發(fā)生于遠(yuǎn)癌 旁肝組織區(qū)域(＞1 cm)。

4 超靈敏染色體非整倍體檢測cfDNA染色體不穩(wěn)定性分析[11]用QIAseq cfDNA提取試劑盒(QIGEN)從血漿中提取cfDNA。執(zhí)行下一代測序。將DNA片段化為300 bp(ctDNA無片段化)，然后用100 ng的片段化基因組DNA(cfDNA 10 ng)制備測序文庫(NEBNext Ultra II)。將8 bp條形碼測序接頭與DNA片段連接后進(jìn)行PCR擴增[12]。用Illumina X10進(jìn)行分析，應(yīng)用R包DNACopy中的循環(huán)二進(jìn)制分割(CBS)算法尋找有意義的基因組斷裂點和拷貝數(shù)變化的基因組片段，分析拷貝數(shù)變化。為每個樣本收集了至少1 000萬個成對的讀數(shù)。這些讀數(shù)被定位到人類參考基因組hg19。然后使用軟件Samtools mpileup計算基因組每個200 k數(shù)據(jù)集的平均覆蓋率。使用公式1對所有數(shù)據(jù)集的平均覆蓋率進(jìn)行歸一化：

最后利用公式2將全基因組與人類參考基因組對比的變異程度，總結(jié)為染色體不穩(wěn)定分?jǐn)?shù)( CIN分?jǐn)?shù))。∑

5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0和R軟件3.4.3版。計量資料以 xˉ±s (正態(tài)分布)或Md(IQR)(非正態(tài)分布)表示，分類變量資料使用例數(shù)和百分比表示。計量資料組間比較采用方差分析或秩檢驗，分類變量采用χ2檢驗或Fisher’s精確檢驗。運用受試者工作特征(ROC)計算曲線下面積(AUC)及95% CI評估各項指標(biāo)預(yù)測MVI的價值，并計算敏感度、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。運用Kaplan-Meier乘積限法建立生存曲線模型，組間生存率比較為log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué) 意義。

結(jié) 果

1 患者一般及臨床資料 本研究共納入49例患者。43例HCC患者中男性38例，女性5例，平均年齡58歲。6例良性腫瘤患者中男性1例，女性5例，平均年齡58歲，病理類型包括壞死性結(jié)節(jié)、梅毒樹膠腫、上皮樣腫瘤、膽管囊腺瘤以及肝 局灶性結(jié)節(jié)樣增生。

2 49例肝腫瘤患者染色體不穩(wěn)定性及其評分 如圖1所示，相較于良性病變患者，HCC患者的血漿樣本中有顯著的染色體拷貝數(shù)變異。染色體1q、6p和8q的獲得頻率較高。染色體4q和10q經(jīng)常丟失。如圖2A所示，對患者的CIN評分進(jìn)行l(wèi)og10轉(zhuǎn)換后，HCC患者的CIN評分高于良性病變患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(3.152±0.421 vs 2.282±0.099，P＜0.05)。如圖2B所示，當(dāng)染色體不穩(wěn)定性評分取值788.8時，可以預(yù)測62.8%的惡性腫瘤，特異性為100%，曲線下面積達(dá)到最大值0 .748，是用于預(yù)測惡性腫瘤的最佳取值。

3 HCC患者一般情況與CIN評分的關(guān)系 CIN評分 ≥ 788.8與腫瘤大小、甲胎蛋白水平有關(guān)，而與性別、年齡、乙肝病毒拷貝數(shù)、腫瘤計數(shù)無關(guān)(表1)。43例肝癌患者中有3例(6.98%，95%CI：2.40% ～ 18.6%)CTC篩查陽性，27例(62.8%，95% CI：47.9% ～ 75.6%)CIN評分 ≥ 788.8。CTC篩 選HCC患者的陽性率低于CIN評分(P＜0.05)。

圖 1 染色體拷貝數(shù)變異覆蓋率圖示(A：HCC患者；B：良性腫瘤患者)Fig.1 Chromosome copy number coverage chart (A: HCC patients; B: Benign tumor patients)

圖 2 49例患者的染色體不穩(wěn)定性評分及ROC曲線A：HCC患者及良性腫瘤患者CIN評分比較；B：CIN評分為788.8時預(yù)測HCC的能力Fig.2 . Results of CIN scores and ROC curves in 49 patients A: Comparison of CIN score between the HCC patients and the benign tumor patients; B: Ability to predict HCC with CIN score of 788.8

圖 3 CIN評分與微血管侵犯的相關(guān)性A：不同MVI程度患者以及良性腫瘤患者CIN平均值；B：CIN評分≥1 679.5預(yù)測MVI；C：CIN評分≥1 679.5預(yù)測MVI 2Fig.3 Correlation between CIN scores and MVI A: Mean CIN of patients with different degrees of MVI and benign tumors; B: CIN score ≥ 1 679.5 in predicton of MVI; C: CIN score≥ 1 679.5 in predicton of MVI 2

表 1 HCC患者各項臨床指標(biāo)與CIN評分的關(guān)系(n)Tab. 1 Relationship between clinical indicators and CIN score in the HCC patients (n)

4 CIN評分與微血管侵犯的關(guān)系 如圖3A所示，隨著疾病進(jìn)展，肝細(xì)胞癌患者血漿CIN評分升高。良性病變、不同程度的MVI(M0、M1、M2)患者的CIN評分平均值分別為643、1 218、2 314、3 487。HCC患者中，MVI陽性組的血漿CIN評分明顯高于MVI陰性組(P＜0.05)。如圖3C所示，當(dāng)CIN評分取值為1 697.5時，可得最大曲線下面積0.772。此時預(yù)測MVI陽性的敏感度為76.9%，特異性為86.7%，而甲胎蛋白的曲線下面積為0.646(圖3B)。血漿CIN評分預(yù)測MVI=2的敏感度為100%，特異性為86.7%。曲線下面積為0.908，而甲胎蛋白的曲線下面積為0.758(圖3C)。如表2所示，CIN評分可作為預(yù)測MVI的參數(shù)(OR=2.09，95%CI：1.27～3.76，P=0.007)。甲胎蛋白和堿性磷酸酶預(yù)測MVI的OR值分別為1.17 (95% CI：0.99～1.39，P=0.075)和1.02 (95%CI：1.00～1.05，P=0.066)，P值接近0.05。其他指標(biāo)包括血漿膽紅素、白蛋白、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、HBV DNA拷貝數(shù)、主要病灶大小、患者年齡和性別均無 統(tǒng)計學(xué)差異。

5 CIN評分與術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系 截至2020年7月30日，7例(16.3%)患者術(shù)后復(fù)發(fā)，無病生存期分別為41 d、74 d、132 d、163 d、169 d、188 d和208 d(圖4A)。其中5例患者CIN評分較高(≥1 679.5)，1例 患 者CIN篩 查 陽 性(≥ 788.8)。CIN評分較高(≥ 1 679.5)的患者與其他患者相比，無病生存率較低(log-rank檢驗：P＜0.05，圖4B)。14例cfDNA CIN評分較高(≥ 1 697.5)的患者中有5例在隨訪期內(nèi)復(fù)發(fā)(35.7%，95% CI：16.3～61.2%)。而cfDNA CIN評分較低者(＜1 697.5)僅有2例 復(fù) 發(fā)(5.71%，95% CI：1.58～18.6%)。CIN升高不僅預(yù)測MVI，還可預(yù)測復(fù)發(fā)(圖4，H R=5.71，95% CI：2.47～13.2，P=0.019)。

表 2 各項檢查指標(biāo)與MVI的關(guān)系Tab. 2 Relationship between each index and MVI

圖 4 CIN高評分(≥ 1 679.5)與術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性A：HCC患者的CIN評分與術(shù)后隨訪，其中黑色線代表CIN高評分，藍(lán)色系代表CIN低評分，紅色線代表腫瘤復(fù)發(fā)，綠色線代表未復(fù)發(fā)；B：HCC患者術(shù)后無病生存曲線，紅色代表CIN低評分，藍(lán)色代表CIN高評分Fig.4 Correlation between CIN ≥ 1 679.5 and postoperative recurrence A: CIN score and postoperative follow-up of HCC patients,in which the black line represents the CIN high score, the blue line represents the CIN low score, the red line represents tumor recurrence, and the green line represents no recurrence;B: Postoperative disease-free survival curve for HCC patients,with red representing low CIN score and blue representing high CIN score

討 論

本研究首次提出以cfDNA的染色體不穩(wěn)定性評分作為指標(biāo)在術(shù)前預(yù)測MVI，血漿CIN評分預(yù)測MVI陽性的敏感度為76.9%，特異性為86.7%，預(yù)測MVI=2的敏感度為100%，特異性為86.7%。這種高效的檢測方法為醫(yī)生提供了一個更好的術(shù)前預(yù)測患者M(jìn)VI的工具，并且根據(jù)初步的隨訪結(jié)頁碼 電子書="21" 紙書="15"/>果，cfDNA的染色體不穩(wěn)定性與患者的不良預(yù)后相關(guān)，這提示其可作為一個預(yù)后指標(biāo)，對術(shù)后患者是否選擇積極使用經(jīng)導(dǎo)管動脈栓塞化療術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)、靶向藥物等治療提供參考。

肝細(xì)胞肝癌患者腫瘤的數(shù)量、大小、位置、血管侵犯和肝功能是評估患者病情和制訂治療方案的重要標(biāo)準(zhǔn)[13]。近年的研究表明，MVI也是HCC患者術(shù)前選擇治療方案的重要參數(shù)。對于BCLC分期極早期的患者，建立有效預(yù)測MVI的模型有助于協(xié)助臨床決斷是否使用擴大手術(shù)邊界的肝切除方式，以及采用視頻消融治療是否合理。對于BCLC進(jìn)展期的患者，術(shù)前預(yù)測為低MVI風(fēng)險的患者選擇積極的手術(shù)治療較TACE可獲得更好的生存獲益[14]。

由于MVI對于HCC患者選擇治療方案具有指導(dǎo)意義，而MVI只有在術(shù)后對切除的標(biāo)本進(jìn)行顯微鏡檢查后才能被診斷出來。所以目前有多項研究試圖通過術(shù)前的影像學(xué)和液體活檢對患者的MVI進(jìn)行預(yù)測。

在影像學(xué)方面，Chou等[15]將腫瘤的CT檢查結(jié)果分為3種亞型：1)規(guī)則的單結(jié)節(jié)型；2)向周圍組織凸起生長的單結(jié)節(jié)型；3)多結(jié)節(jié)融合型。其應(yīng)用該分型對HCC患者進(jìn)行了前瞻性研究。結(jié)果表明，后兩種亞型與MVI存在明顯相關(guān)性，并且預(yù)測MVI的敏感度為81.7%，特異性為88.1%。Huang等[16]對HCC患者術(shù)前Gd-EOB-DTPA動態(tài)增強MRI進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑較大、腫瘤邊緣不規(guī)則和動脈中期腫瘤周圍增強是MVI的預(yù)測因素。此預(yù)測模型的敏感度和特異性分別為52.9%和93.0%。雖然腫瘤的影像學(xué)特征能夠用于術(shù)前預(yù)測MVI，但如何界定這些影像學(xué)特征主要依賴醫(yī)生的主觀判斷，缺乏客觀量化的指標(biāo)，這導(dǎo)致這些研究成果存在爭議，難以普及[17]。

在液體活檢方面，You等[18]通過回顧性研究提出AFP＞400 μg/L、腫瘤直徑＞3.1 cm、脾功能亢進(jìn)與MVI獨立相關(guān)，且預(yù)測模型的敏感度為75.6%，特異性為75.3%。Zhu等[19]構(gòu)建了ALP與淋巴細(xì)胞比例(ALP-to-lymphocyte ratio，ALR)的預(yù)測模型，ALR預(yù)測MVI的敏感度和特異性分別為76.0%和76.4%。另外還有研究表明血清GGT、淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞比例、衍生的中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比例與MVI有相關(guān)性[20-21]。

對于目前已存在的術(shù)前預(yù)測MVI的方法，cfDNA的染色體不穩(wěn)定性評分作為液體活檢較影像學(xué)檢查更具有普及性。本研究中，cfDNA的染色體不穩(wěn)定性評分預(yù)測MVI陽性的敏感度為76.9%，特異性為86.7%(以優(yōu)化的臨界值1 697.5為標(biāo)準(zhǔn))，優(yōu)于現(xiàn)有的液體活檢檢測模型。

目前射頻消融廣泛用于治療早期肝細(xì)胞肝癌患者，相對于肝切除手術(shù)，射頻消融治療對患者的損傷更小，有報道指出對于2～5 cm的單發(fā)病灶，射頻消融與手術(shù)切除的預(yù)后基本相同[22]，但也有研究指出，對于有高危復(fù)發(fā)因素的患者，無論其腫瘤大小，都應(yīng)該優(yōu)先考慮解剖性切除而不是射頻消融[23]。對于CIN評分較高(≥ 1 697.5)能夠在術(shù)前有效的預(yù)測MVI風(fēng)險的患者，解剖性切除可能是更安全的治療方法。

根據(jù)現(xiàn)有隨訪數(shù)據(jù)得出的cfDNA的染色體不穩(wěn)定性評分與術(shù)后早期復(fù)發(fā)的相關(guān)性值得深入研究，cfDNA的染色體不穩(wěn)定性評分預(yù)測MVI高危組M2的敏感度為100%，特異性為86.7%，這提示MVI與腫瘤的細(xì)胞學(xué)進(jìn)展密切相關(guān)，高危組的患者具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險，cfDNA的染色體不穩(wěn)定性評分能夠更好地篩選出這些患者，制訂個性化的術(shù)后治療方案，及早聯(lián)合使用免疫治療、靶向藥物治療、TACE治療等輔助治療方法，以期降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，延長生存時間，使患者受益[24]。

本研究存在一定的局限性。首先，本項研究納入的病例數(shù)較少，且來自單個研究中心，數(shù)據(jù)有其固有的缺陷，本醫(yī)院作為高級別大型三甲醫(yī)院，許多患者在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院無法切除后來我院治療，所以病例存在手術(shù)難度較大的情況，這也是本組患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率為16.3%的主要原因。后期研究應(yīng)設(shè)計更好的前瞻性多中心研究，以進(jìn)一步評估cfDNA預(yù)測HCC患者是否有MVI的作用。其次，cfDNA陽性患者與cfDNA陰性患者的長期預(yù)后是否也如短期預(yù)后一樣呈現(xiàn)差異性，有待進(jìn)一步隨訪和研究。

綜上所述，我們的研究首次證明cfDNA是預(yù)測HCC患者M(jìn)VI風(fēng)險的一種可行且簡單的方法。這種新的方法的優(yōu)點是敏感度較高、可靠和且兼具診斷和預(yù)后預(yù)測功能，可以在術(shù)前較為準(zhǔn)確地預(yù)測MVI。我們的研究結(jié)果證明基因和染色體變化與肝癌患者的MVI風(fēng)險相關(guān)。