枯草芽孢桿菌對土壤群落結構的影響

邱萌萌，吳玉斌，陸洪省

（山東科技大學安全與環境工程學院，山東青島 266000）

芽孢桿菌是土壤和植物微生態區系的優勢生物種群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用?？莶菅挎邨U菌是芽孢桿菌中性狀優良的分離株，其生理特征多樣，在自然界中廣泛分布，極易分離培養?？莶菅挎邨U菌不僅可以廣泛存在于土壤、植物根際表面和其他外部環境中，而且可以存在于植物體內，是植物體內常見的內生細菌，尤其是在植物的根部、莖部。該菌不僅對人畜無毒無害，不污染環境，而且能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力?？莶菅挎邨U菌可通過成功定殖至植物根際、體表或體內的方式，與病原菌競爭植物周圍的營養，分泌抗菌物質以抑制病原菌生長，同時誘導植物防御系統抵御病原菌入侵，改變植物根際土壤中微生物群落結構，從而達到生防的目的，已成為一種理想的生防細菌［1-3］。

高通量測序技術是目前應用最廣泛的新一代測序技術，與傳統的瓊脂培養基培養、Biolog 平板法、磷脂脂肪酸、PCR-DGGE 和RFLP 等分析方法相比，具有通量高、靈敏度高、準確性高和運行成本低等特點。高通量測序技術通過檢測土壤微生物細胞內特定遺傳物質（原核微生物16S rRNA、真核微生物18S rRNA）的堿基序列，可以更全面、準確地分析土壤中微生物群落的多樣性，已廣泛應用于土壤微生物群落的研究中［4-6］。本研究通過枯草芽孢桿菌與致病菌的對峙實驗驗證枯草芽孢桿菌的抑菌作用，通過高通量測序的方法探究枯草芽孢桿菌對土壤中微生物群落的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（1 000 億孢子/g）由河北冠龍農化有限公司提供；茄鏈格孢菌、灰葡萄孢菌為山東科技大學環境微生物實驗室之前分離得到的菌株；土樣由山東省安丘市萬芳蔬菜種植大棚提供。

枯草芽孢桿菌液體培養基：20 g 葡萄糖、15 g 蛋白胨、5 g 氯化鈉、0.5 g 牛肉膏、1 000 mL 水。固體培養基按20%的比例加入瓊脂即可。

茄鏈格孢菌、灰葡萄孢菌培養基為PDA 培養基。

1.2 菌株的分離鑒定

取5 g 枯草芽孢桿菌可濕性粉劑于10 mL 無菌水中搖勻、溶解。利用無菌接種環蘸取枯草芽孢桿菌溶液在枯草芽孢桿菌固體培養基上劃線接種，重復3 個。將接種完成的培養基于自然光、28 ℃環境下培養、觀察。待培養基中長出菌落后，挑選與枯草芽孢桿菌顏色形態一致的菌落，委托青島睿博興科生物技術有限公司進行測序。

1.3 平板對峙實驗

將實驗室保存的茄鏈格孢菌、灰葡萄孢菌進行活化培養后，采用含毒介質法觀察枯草芽孢桿菌對兩種致病菌的抑制作用。

將分離得到的枯草芽孢桿菌接入液體培養基中培養3 d，5 000 r·min-1離心15 min，取上清液，用0.22 μm的無菌濾膜過濾得無菌濾液。PDA 固體培養基在無菌滅菌鍋中滅菌，冷卻至60 ℃時，分別按枯草芽孢桿菌無菌濾液與PDA 培養基體積比為1 ∶3 和1 ∶9 的比例制成含毒培養基，倒入提前滅菌好的培養皿中冷卻，備用。

在不同比例的含毒培養基的中心處分別接入直徑為9 mm 的茄鏈格孢菌、灰葡萄孢菌菌餅，以不加枯草芽孢桿菌無菌濾液的PDA 培養基為對照，每組重復3 次。在自然光、28 ℃條件下培養 d，觀察枯草芽孢桿菌對病原菌的抑制作用，計算抑制率，見公式（1）。

1.4 高通量測序

取5 g 土樣于50 mL 水中攪拌、溶解，靜置6 h 取上清液得土壤浸出液。

分別取1 mL 土壤浸出液于兩個100 mL 錐形瓶中，其中一個加入20 mL 枯草芽孢桿菌液體培養基，另一個加入20 mL 枯草芽孢桿菌液體培養基后再加入1 mL 枯草芽孢桿菌培養2 d 的培養液作為對照。培養7 d 后委托上海生工生物工程有限公司進行高通量測序，分析枯草芽孢桿菌對土壤真菌菌群群落結構和多樣性的影響。

1.5 數據整理

利用Word 2010、Excel 2010 進行數據處理、制圖、制表，利用MEGA5.1 進行系統樹的構建。

2 結果與分析

2.1 菌株系統分類學鑒定

將測得的序列在NCBI 數據庫中進行BLAST 同源性比對，與數據庫中各菌株序列進行相似性分析，所測枯草芽孢桿菌菌株與Bacillus subtilisstrain BS-S3 菌株的一致性達99%。用MEGA5.1 軟件對同源性較高的序列進行序列分析并使用Neighbor-Joining 法構建系統發育樹，系統發育樹如圖1 所示。該序列和Bacillus subtilisstrain BS-S3菌株在同一分支，結合其生物學特性及形態學特征，確定該菌株為枯草芽孢桿菌，并命名為SKD-QM11。

2.2 抑菌作用

經過5 d 培養后發現，無論枯草芽孢桿菌和PDA 培養基的比例為1 ∶3 還是1 ∶9，對茄鏈格孢菌和灰葡萄孢菌的抑制作用都非常強，其抑制效果如圖2、3 所示。采用十字交叉法對菌餅直徑進行測量發現，菌餅大小無變化，由抑制率公式得，枯草芽孢桿菌對茄鏈格孢菌和灰葡萄孢菌的抑制率達到100%。

圖1 基于16S rDNA 序列構建的SKD-QM11 系統發育樹

圖2 茄鏈格孢菌實驗組與對照組培養5 d 生長情況

圖3 灰葡萄孢菌實驗組與對照組培養5 d 生長情況

2.3 對土壤真菌菌群的影響

由高通量測序結果得，加入枯草芽孢桿菌的土壤浸出液中OTU 數為147，僅加入液體培養基的土壤浸出液中OTU 數為20，說明加入枯草芽孢桿菌會豐富土壤中真菌菌群組成，使真菌種類增多。由表1 可得，在門水平上，加入枯草芽孢桿菌培養液與只加入培養基相比，真菌優勢菌有所變化。只加入培養基的土壤浸出液中，變形菌門占了99.95%，幾乎所有真菌都屬于變形菌門；加入枯草芽孢桿菌的土壤浸出液中，變形菌門所占的比例為63.41%，較只加入培養基的土壤浸出液中變形菌門的比例小，但是莫氏菌門為20.09%，擔子菌門比例也有所增加，球囊菌門的真菌由無到有，雖然所占比例較小，但增加了真菌種類，說明加入枯草芽孢桿菌會改變土壤浸出液中門水平的真菌組成。

表1 門水平真菌的變化

3 結論

本實驗分離出的枯草芽孢桿菌能夠抑制茄鏈格孢菌和灰葡萄孢菌的菌絲生長，對其產生的抑制作用可達到100%。吳穎等人發現，枯草芽孢桿菌抑制茄鏈格孢菌菌絲和分生孢子的生長［7］。李永剛等報道，枯草芽孢桿菌BS2 的菌液成分及胞外蛋白能有效抑制灰葡萄孢菌的產孢、萌發和菌絲生長［8］。黃華毅等人發現，枯草芽孢桿菌菌液處理病原真菌后，其產生的抗菌物質主要通過溶解細胞壁或細胞膜造成原生質泄漏使菌絲斷裂或畸形［9］?？莶菅挎邨U菌對植物病原菌具有較強的抑制作用，具有較好的開發前景。

由高通量測序結果可得，枯草芽孢桿菌會改變土壤浸出液中真菌菌群的組成，豐富真菌類別。陳雪麗等利用DGGE-PCR 技術證明在盆栽條件下接種B.subtilis BRF-2 和Paenibacillus polymyxaBRF-1 對不同時期黃瓜和番茄根際土壤中真菌群落結構產生了一定的影響，特別是對番茄根際土壤真菌群落結構影響較大［10］。余賢美等人通過固體平板法和Biolog 法分析了具有良好定殖能力的B.subtilis Bs-15 對棗樹根際土壤中微生物的影響，發現其會提高土壤微生物的整體活性以及土壤微生物種群和功能多樣性［11］。在本研究中，針對真菌門分類水平，雖然優勢菌種類未改變，但是所占比例有所改變，而且提高了其他種類真菌所占的比例，無論是土壤浸出液中的真菌種類還是真菌數量，均可被枯草芽孢桿菌明顯改變。