添加不同乳酸菌對青貯玉米和青貯黑麥草發酵品質、有氧穩定性的影響

趙峻祥，李金庫，王雪洋，劉 晨，孫奉召，李井春，魏國生，李雁冰

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

青貯（silage）是在嚴格密閉的環境中，使青貯原料發酵足夠長的時間， 在此期間保持其質量相對穩定的一種保鮮技術［1］。 青貯原料應選擇易被好氧微生物損壞， 可以在厭氧條件下靠乳酸菌發酵得以長期保存的原料［2-3］。 營養價值、發酵品質和有氧穩定性是鑒定青貯飼料品質的重要指標，發酵品質通過pH 值、有機酸含量和微生物菌落數評定［4］。 大量研究表明，乳酸菌添加劑可以很好地改善青貯飼料的發酵品質， 使發酵過程中乳酸菌數量增多，在微生物群落中占據主導地位，使pH值快速降低，乳酸含量較乙酸含量高［5］。 Kharazian等［6］在玉米青貯飼料中分離出了抗真菌活性高的乳酸菌，可用作青貯飼料添加劑提高青貯品質，研究結果表明， 在青貯飼料中加入同型乳酸菌可以提高發酵品質。 Yuan 等［7］人在青貯飼料中添加同型乳酸菌使得乳酸含量高于對照組。 同型乳酸菌可以提高發酵品質， 但對有氧穩定性的提升作用并不顯著，近年來，為了減少有氧穩定性差造成的飼料損失， 很多學者采用異型乳酸菌作為飼料添加劑［8-9］。 也有學者提出將同型、異型乳酸菌聯合添加到青貯飼料中，可以在保證發酵品質良好的情況下，提高有氧穩定性［10-11］。Parvin 等［12］研究發現，向黑麥草和幾內亞草中添加乳酸菌可以與附生乳酸菌進行競爭，通過菌落分析，幾乎檢測不到添加的乳酸菌以外的微生物。 基于此，該試驗設置了添加同型乳酸菌和異型乳酸菌兩個菌種進行青貯，添加的同型乳酸菌為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，PA）， 異型乳酸菌為短乳桿菌（Lactobacillus brevis，LB），研究單一添加和聯合添加上述2 種菌對青貯飼料發酵品質和有氧穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 青貯的調制與貯存

選用乳熟期全株玉米和開花期黑麥草， 全株玉米經鍘草機切碎至1～2 cm 直接青貯，黑麥草青貯前預干4～8 h 至干物質含量為30%～50%，再經鍘草機切碎至1～2 cm 后青貯。 試驗設置4 個組：添加自來水處理組，記為對照組；添加乳酸片球菌處理組，記為PA 組；添加短乳桿菌處理組，記為LB 組； 乳酸片球菌和短乳桿菌聯合添加處理組，記為PA+LB 組。 將乳酸片球菌和短乳桿菌凍干粉末用自來水溶解稀釋，以2 mL/kg 的劑量均勻噴灑在原材料上，以保證每克原料上的乳酸菌達到106CFU，對照組添加自來水2 mL/kg。 將處理好的原料300 g 放入0.05 mm 厚的塑料袋（27 mm×39 mm），利用真空封口機抽氣封口，置于恒溫環境（25 ℃）中發酵，保存在25 ℃恒溫室內，貯存30 d。 每個處理3 個平行樣本。 乳酸片球菌和短乳桿菌分離于發酵TMR。

1.2 化學成分及微生物菌落數分析

1.2.1 干物質含量測定DM 測定： 采用60 ℃，48 h 干燥法。

1.2.2 樣品處理在30 d 開袋時取樣，稱取樣品20 g， 放入實驗用樣品袋， 加180 mL 無菌生理鹽水，密封，在搖床上以120 r/min 搖動10 min。 用3層無菌紗布過濾青貯草渣， 濾液用于青貯飼料的乙醇、乳酸、短鏈脂肪酸含量和pH 值的測定。

1.2.3 pH 值測定用梅特勒Ps-2 型酸度儀測定pH 值。

1.2.4 有機酸含量測定有機酸含量采用液相色譜法測定：將青貯濾液經0.20 μm 的過濾器過濾，取10 μL 過濾后的濾液加入色譜柱。 色譜條件為：色 譜 柱 ICSep COREGEL -87H column （Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan）（8 μm，7.8 mm×100 mm）； 流動相0.004 mol/L 硫酸, 臨用前用超聲波脫氣；流速0.6 mL/min；進樣20 μL；溫度60 ℃。

1.2.5 微生物菌落數分析乳酸菌的培養采用MRS 培養基， 酵母菌的培養采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基。 微生物菌落數采用微生物平板菌落計數法獲得。

1.3 有氧穩定性試驗

所有青貯飼料達到貯存日期后開封， 取出150 g 樣本，放入500 mL 的無菌廣口瓶，樣本正中插入溫度計，并敞口放置7 d，環境溫度為25 ℃恒溫。 每日2 次（6：00 和18：00）記錄室溫和所有樣本的溫度， 當樣本的溫度超過室溫2 ℃時判定為樣本腐敗。 7 d 后檢測pH 值和發酵產物，pH 值上升幅度小,有氧穩定性較好,反之則較差。

1.4 統計分析

利用IBM SPSS Statistics 19 軟件方差分析中的Duncan′s 方法進行多重比較，判斷數值間的差異性，P＜0.05 代表差異顯著。

2 結果

2.1 全株玉米貯藏30 d 后的有機成分和微生物組成

由表1 可知，在青貯玉米貯藏30 d 后，各組pH 值均低于4.0。 各組乳酸含量無顯著差異（P＞0.05）；LB 組和PA+LB 組乙酸值顯著 （P＜0.05）高于其他組， 乙酸可以抑制青貯飼料中好氧微生物的活性，提高飼料的有氧穩定性，同時乙酸含量高會影響飼料的適口性；對照組和LB 組的乙醇含量顯著（P＜0.05）高于PA 組和PA+LB 組，乙醇含量高會對青貯飼料的營養價值有一些不良影響；添加乳酸菌的3 個組乳酸菌數量顯著（P＜0.05）高于對照組；LB 組和PA+LB 組酵母菌數量低于對照組和PA 組（P＜0.05），酵母菌數量高不利于改善青貯飼料的發酵品質。

2.2 乳酸菌對青貯玉米有氧穩定性的影響

通過有氧穩定性試驗可知（見表2），對照組在開封后1 d 腐敗，PA 組和LB 組分別在2 d 和2.5 d 腐敗；PA+LB 組5 d 后腐敗， 與其他組相比延后。

經過7 d 有氧穩定性試驗， 與表1 中對應的各個指標比較，各組pH 值顯著（P＜0.05）增加；各組乳酸、乙酸和乙醇含量明顯降低（P＜0.05）。 由表3 可知，PA+LB 組pH 值顯著（P＜0.05）低于其他各組，乳酸含量顯著（P＜0.05）高于其他各組；乳酸菌和酵母菌數量各組無顯著差異（P＞0.05）。

表1 全株玉米貯藏30 d 后青貯飼料成分分析

表2 各組玉米青貯飼料有氧穩定性分析 單位：d

表3 有氧穩定性試驗后的青貯玉米飼料成分分析

表4 黑麥草貯藏30 d 后青貯飼料成分分析

2.3 黑麥草貯藏30 d 后的有機成分和微生物組成

由表4 可知，對照組pH 值顯著（P＜0.05）高于其他各組；PA 組乳酸含量顯著（P＜0.05）高于其他各組；LB 組和PA+LB 組乙酸含量高于其他各組；PA 組乙醇含量顯著（P＜0.05）低于其他各組；LB 組和PA+LB 組未檢測到酵母菌，乳酸菌數量低于對照組和PA 組（P＜0.05）。

2.4 乳酸菌對青貯黑麥草有氧穩定性的影響

由表5 可知， 對照組青貯飼料在2 d 后發生腐敗； 添加乳酸菌的各試驗組青貯飼料的有氧穩定性都大于7 d，有氧穩定性好。

經過7 d 有氧穩定性試驗，與表4 比較，對照組pH 值因為腐敗而增加（P＜0.05），乳酸含量升高（P＜0.05），乙醇含量降低（P＜0.05）；添加乳酸菌的各組pH 值無明顯變化，乳酸含量增加（P＜0.05），乙醇含量降低（P＜0.05）。 由表6 可知，添加乳酸菌的各組pH 值顯著（P＜0.05）低于對照組，乳酸含量顯著 （P＜0.05） 高于對照組；LB 組乙酸含量顯著（P＜0.05）高于其他各組，可能是由于LB 為異型乳酸菌，主要產物為乙酸；乳酸菌數量各組無顯著差異（P＞0.05）；對照組酵母菌數量顯著（P＜0.05）高于PA 組，LB 組和PA+LB 組未檢測到酵母菌。

表5 各組黑麥草青貯飼料有氧穩定性分析 單位：d

3 討論

3.1 乳酸菌添加劑對青貯玉米發酵品質和有氧穩定性的影響

該試驗中， 全株玉米發酵30 d 后各組pH 值都低于4.0，青貯效果良好；各添加乳酸菌的試驗組乳酸菌數量顯著高于對照組；PA 組和聯合添加組乙醇含量顯著低于LB 組和對照組，主要原因是由于PA 屬于同型乳酸菌， 可以顯著降低乙醇含量。各組乳酸含量無顯著差異，乳酸含量是決定青貯飼料品質的重要因素［13］，該結果說明乳酸菌添加劑對青貯玉米品質的提升無顯著作用， 這可能是因為玉米自身的可溶性糖（WSC）含量高，為乳酸菌提供充足的發酵底物，可以產生大量乳酸，即使不使用乳酸菌添加劑， 也可以保證產出足夠多的乳酸［14］。PA 組乙酸含量和酵母菌數量都與對照組無顯著差異， 主要是由于同型乳酸菌主要產物為乳酸，產生可以抑制酵母菌的短鏈脂肪酸很少。LB 組的乙酸含量顯著高于對照組，酵母菌數量顯著低于對照組， 這是因為異型乳酸菌主產物為乙酸，乙酸可以抑制酵母菌的生長，對提高青貯飼料有氧穩定性有一定幫助［15］，但乙酸含量高會降低飼料的適口性。 在有氧穩定性試驗中，PA 組在2 d后就出現腐敗， 這是因為同型乳酸菌產生的乙酸較少，不能很好地抑制酵母菌和霉菌，與Muck［16］和Conaghan 等［17］的報道一致；LB 組在2.5 d 后pH 值上升，出現腐敗，說明通過在青貯玉米中單獨添加異型乳酸菌提高飼料有氧穩定性結果并不理想。 很多研究表明同型乳酸菌降低了青貯飼料的有氧穩定性， 但與異型乳酸菌聯合作用時則改善了青貯飼料的有氧穩定性。 張濤等［18］研究表明在苜蓿中添加青貯菌劑，有效提高了有氧穩定性。魏日華［19］研究表明，在無芒燕麥中添加不同乳酸菌對于青貯有氧穩定性的提高有明顯作用。 上述試驗受菌種搭配和原料影響， 對于提高青貯的有氧穩定性效果不同，但結果類似。該試驗中青貯玉米聯合添加組在5 d 后才腐敗， 乳酸含量顯著高于其他各組，這是因為乙酸在前期被消耗，為乳酸菌提供了充足的發酵底物，有氧暴露后，乳酸含量仍然升高，且pH 值低于4.5，有氧穩定性優于其他添加組，說明PA 和LB 聯合添加對青貯玉米有氧穩定性有一定的改善作用。

3.2 乳酸菌添加劑對青貯黑麥草發酵品質和有氧穩定性的影響

該試驗中的青貯黑麥草在發酵30 d 后，添加乳酸菌的各組pH 值與對照組相比都顯著降低，說明在黑麥草中添加乳酸菌對于降低pH 值有顯著作用。 添加同型乳酸菌PA 的PA 組，乳酸菌和酵母菌與對照組差異不顯著； 乳酸含量為各組中最高，乙醇含量為各組中最低；乙酸含量低于其他乳酸菌添加組，可以增加青貯飼料的適口性。 PA 單獨添加和聯合添加對于黑麥草發酵品質都有一定的改善作用。 在有氧穩定性試驗中，PA 組、LB 組和PA+LB 組的黑麥草都在7 d 后才出現腐敗，且各組pH 值顯著低于對照組，在青貯黑麥草中單獨添加PA，也可使有氧穩定性增強，但在青貯玉米中并沒有顯效， 可能與青貯原料不同或是原料自身附著的微生物不同有關； 在黑麥草有氧穩定性試驗中，PA 組有氧穩定性同LB 組、PA+LB 組無差別，但仍能檢測出酵母菌，其抑制腐敗能力不如LB 組和PA+LB 組強大；在有氧穩定性試驗后，LB組乙酸含量顯著高于其他各組， 乙酸過高導致飼料適口性降低，影響動物生產力，這也是異型乳酸菌的弱點；而PA+LB 組，在有氧穩定性試驗后，抑制腐敗的能力與LB 組類似，但乙酸含量顯著低于LB 組，乳酸含量高于PA 組，說明兩種乳酸菌聯合添加時具有協同作用， 在保證具有較高乳酸含量的同時還能提高有氧穩定性。

4 結論

乳酸片球菌和短乳桿菌聯合添加對青貯玉米的有氧穩定性具有一定的改善作用； 單獨添加乳酸片球菌對青貯黑麥草發酵品質的改善效果最優； 向青貯黑麥草中聯合添加乳酸片球菌和短乳桿菌既可以保證良好的氧穩定性， 還能改善飼料發酵品質。