微波水解—氨基酸自動分析儀法測定飼料中色氨酸的含量

宋 潔，王麗芳，姚一萍，史 培，鐘華晨，郭晨陽，張欣昕，黃 潔

［1.農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室（呼和浩特） 內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；2.內蒙古自治區動物營養與飼料科學重點實驗室 內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018］

色氨酸（tryptophan） 是一種功能性必需氨基酸，分為D-型、L-型和DL-型3 種同分異構體，天然存在且易被動物代謝吸收的為L-型［1］。 L-色氨酸是除酪氨酸和蛋氨酸之外的三大氨基酸飼料添加劑之一，不僅能參與蛋白質的生物合成，而且是5-羥色胺、褪黑素、色胺、煙酸等典型生理活性物質的生化前體，具有促進動物生長發育、提高免疫力、改善肉品質等作用［2-4］。 由于動物自身不能合成色氨酸，必須從飼料中攝取，飼料中色氨酸含量的準確測定， 對于動物體內色氨酸平衡及正常新陳代謝至關重要［5-6］。

目前，色氨酸的測定主要通過常規堿水解，結合高效液相色譜或分光光度法。 然而常規堿水解耗時過長，色氨酸會被輕微破壞，烘箱溫度也不易控制［7］。 此外，液相色譜法存在出峰較慢、分析時間長、檢測靈敏度低等問題。分光光度法易受顏色深淺或雜質干擾，影響測定結果準確性［8］。 近年來，微波技術因其反應快、能耗低、易操作等優勢日益受到關注。采用微波堿水解法水解樣品，不但可以避免常規堿水解的缺點， 而且易于控制堿水解條件，結合全自動氨基酸分析儀上機測定，兩者均具有安全、省時、操作簡便等優點。 氨基酸含量測定主要受水解時間、 水解溫度及水解液濃度等因素影響［9］，因此，該研究利用微波消解儀篩選出微波堿水解的最佳堿濃度、水解溫度和水解時間，并聯合氨基酸自動分析儀快速測定飼料中色氨酸含量， 建立的方法適用于大規模飼料樣品中色氨酸的高效、準確測定，對于飼料營養品質評定工作具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-色氨酸標準品（L-Trp，純度≥99%），美國Sigma 公司；甲醇（色譜純），北京迪馬科技公司；氫氧化鈉（分析純），天津市風船化學試劑科技有限公司；鹽酸（優級純），成都市科隆化學品有限公司。飼料樣品為奶牛全混合日糧（TMR），購自內蒙古當地飼料市場。

1.2 儀器與設備

Mars240/50 微波消解儀 （美國CEM 公司）；S433D 氨基酸自動分析儀 （德國Sykam 公司）；XS105 萬分之一天平 （瑞士Mettlr Toledo 公司）；ED115 干燥箱（德國Binder 公司）；Milli-QA10 超純水儀（美國Millipore 公司）；TGL-20M 臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）。

1.3 標準溶液的配制

L-色氨酸標準儲備液： 精確稱取色氨酸標準品20.4 mg，加適量水和數滴0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶解，用水定容至100 mL，濃度為1.0 μmol/mL，4 ℃冷藏保存，有效期1 個月。

L-色氨酸標準工作液：準確吸取1.0 mL 色氨酸標準儲備溶液置于10.0 mL 容量瓶， 用水稀釋至刻度，濃度為0.1 μmol/mL，即為色氨酸標準上機液，4 ℃冷藏保存，有效期2 周。

1.4 試驗方法

1.4.1 單因素試驗在微波消解功率1 200 W、升溫10 min、NaOH 為堿解劑條件下，選取水解溫度140、150、160、170、180 ℃，水解時間10、20、30、40 min，堿濃度3、4、5、6 mol/L 分別進行單因素試驗，研究這3 個因素對色氨酸含量測定結果的影響。

1.4.2 正交試驗根據單因素試驗結果， 以水解溫度、水解時間、堿濃度為研究對象，采用L9（34）正交表，設計三因素三水平正交試驗，開展9 次試驗，每次試驗設置3 個重復（見表1）。

表1 微波水解條件篩選正交試驗因素水平表

1.4.3 樣品處理對于脂肪含量小于4%的樣品，準確稱取0.050 0～0.100 0 mg （精確至0.000 1 g），置于聚四氟乙烯消解管中， 加5 mL 氫氧化鈉溶液，充氮氣1 min，根據單因素和正交試驗條件選擇堿濃度、水解溫度和水解時間進行微波水解。取出消解管，冷卻至室溫，轉移至25 mL 容量瓶，用6 mol/L 鹽酸中和，調pH 值至中性，并用水定容，10 000 r/min 離心10 min， 用0.45 μm 濾器過濾后上機測定。對于脂肪含量大于4%的樣品，需要先經過脫脂處理再按上述步驟進行色氨酸含量測定。

1.4.4 統計分析試驗結果采用SPSS 20.0 軟件GLM 方法進行方差分析，并用Duncan′s 法［1］進行多重比較，兩組間比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 色氨酸含量測定單因素試驗結果

2.1.1 微波水解溫度對色氨酸含量測定的影響采用5 mol/L 氫氧化鈉溶液作為水解液，水解時間30 min，研究140、150、160、170、180 ℃水解溫度對色氨酸含量的影響。 結果表明， 隨著測定溫度從140 ℃升高至180 ℃，色氨酸含量逐漸增加（見圖1），當水解溫度≥160 ℃時，TMR 色氨酸含量均顯著（P≤0.05）高于140 ℃時測定結果。 雖然水解溫度升至180 ℃后TMR 色氨酸含量仍有一定增加，但增幅明顯下降， 且由于溫度過高容易導致堿液過沸損失及水解管爆裂， 選擇170 ℃為色氨酸測定最佳水解溫度。

2.1.2 微波水解時間對色氨酸含量測定的影響如圖2 所示，在以5 mol/L 氫氧化鈉溶液作為水解液，提取溫度170 ℃條件下，水解時間在10～30 min時，色氨酸含量迅速升高，水解效率增加，30 min時TMR 色氨酸含量均顯著（P≤0.05）高于其他各時間點，40 min 時色氨酸含量逐漸降低，表明色氨酸在微波照射時間延長后可能發生部分分解［10］。選擇30 min 為最佳水解時間。

2.1.3 微波水解堿濃度對色氨酸含量測定的影響在水解溫度170 ℃，水解時間30 min 條件下，分別選取3、4、5、6 mol/L 的氫氧化鈉作為水解液，不同堿濃度對色氨酸含量的影響見圖3。 隨著堿濃度的增大，色氨酸含量增加，當堿濃度為5 mol/L 時，色氨酸的含量達到最大值， 繼續增加堿濃度時，TMR 色氨酸含量顯著（P≤0.05）降低。由此確定水解液最佳堿濃度為5 mol/L。

2.2 色氨酸含量測定正交試驗結果

圖1 微波水解溫度對飼料色氨酸含量測定的影響

圖2 微波水解時間對飼料色氨酸含量測定的影響

2.2.1 色氨酸含量測定正交試驗極差R 值結果正交試驗極差R 值結果見表2。 影響TMR 色氨酸含量的各因素主次順序為A＞C＞B，說明水解溫度對TMR 色氨酸含量影響最大，與Zhang 等［11］認為水解溫度對氨基酸水解效率影響最大的研究結果一致。 色氨酸含量測定最優組合為A3B2C3，即水解溫度170 ℃、水解時間30 min、堿濃度5 mol/L 效果最佳。

2.2.2 色氨酸含量測定正交試驗方差分析結果正交試驗方差分析結果見表3。 水解溫度、水解時間、堿濃度3 個因素對TMR 色氨酸含量的影響均達到極顯著水平（P＜0.01）。 通過對比偏差平方和、均方可知，A 因素（水解溫度）是影響飼料色氨酸含量測定最主要的因素，與“2.2.1”項下極差R 值分析結果一致。

2.3 色譜條件

氨基酸自動分析儀最佳工作條件：色譜柱為水解氨基酸分析柱LCAK06/Na （4.6 mm×150 mm）；檢測器：570 nm 波長檢測器；流動相：檸檬酸鈉A 0.12 mol/L，pH 值3.45， 檸檬酸鈉B 0.2 mol/L，pH值10.85；流動相流速：0.45 mL/min；茚三酮流速：0.25 mL/min；柱溫：74 ℃；反應器溫度：130 ℃；進樣體積：50 μL。色氨酸標準品及樣品色譜圖見圖4和圖5。

2.4 線性關系及定量限

采用色氨酸標準儲備液（C=1.00 μmol/mL）進行校準曲線繪制。選取色氨酸含量分別為0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500、0.600 mol/mL 的8個濃度點，以色氨酸含量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制工作曲線（見圖6）。 色氨酸的線性方程為Y=76 138.854 3X， 相關系數r=0.999 7，完全符合實驗室要求。 結果表明： 色氨酸在0.025～0.600 μmol/mL 濃度范圍內峰面積與濃度線性關系良好。 以10 倍噪音水平對應濃度確定定量限，該方法定量限為0.05%。

圖3 氫氧化鈉溶液濃度對飼料色氨酸含量的影響

表2 TMR 色氨酸含量測定正交試驗結果

表3 TMR 色氨酸含量測定正交試驗方差分析

圖4 色氨酸標準品色譜圖

表4 飼料色氨酸含量精密度測定結果 單位：%

圖5 飼料樣品色氨酸色譜圖

圖6 飼料色氨酸含量線性關系圖

2.5 精密度

對TMR 飼料進行樣品前處理后，在相同條件下平行進樣6 次， 精密度試驗平均值為0.14%，RSD 為3.58%，詳細結果見表4。 這表明該試驗精密度良好，能夠準確測量色氨酸含量。

2.6 回收率

加標回收率結果見表5，TMR 色氨酸回收率93%～104%，平均值為98%。

2.7 方法對比

由表6 可知，微波堿水解法與國家標準《飼料中色氨酸的測定》（GB/T 15400—2018） 中的常規堿水解法相比具有相近的回收率， 且經過t 檢驗比較， 兩種方法測定色氨酸含量結果無顯著差異（P＞0.05），表明微波堿水解法同樣準確有效。

3 討論

3.1 微波水解條件選擇

水解是色氨酸含量分析的關鍵步驟， 水解質量的好壞直接影響分析結果的準確性［12］。 色氨酸在酸性條件下不穩定、易分解，在使用氨基酸自動分析儀進行測定時， 無法通過酸水解與其他氨基酸同步測出含量，一般通過堿性水解單獨測定［13］。然而， 已有的國家標準及文獻中色氨酸的水解方法多為常規堿水解法， 色氨酸微波堿水解法研究較少，水解溫度、水解時間及NaOH 濃度等微波水解條件變動范圍較大，且多為單因素試驗，并未采用正交試驗進行科學優化組合［14-16］。 水解溫度低保證了色氨酸檢測結果的準確性，但耗時過長；水解溫度過高能大大縮短檢測時間， 但色氨酸結構會被破壞。因此，該試驗通過單因素試驗和正交試驗，篩選出5 mol/L NaOH、170 ℃、水解30 min 作為測定TMR 飼料樣品色氨酸含量的最佳微波堿水解條件，線性關系良好，色氨酸回收率為93%～104%，精密度RSD 為3.58%，表明色氨酸檢測結果準確，并未受到溫度的影響。

3.2 微波堿水解法與常規堿水解法比較

采用國家標準《飼料中色氨酸的測定》（GB/T 15400—2018）中的常規堿水解法，使蛋白質在堿的作用下，充氮氣密封，放入110 ℃恒溫干燥箱，水解20 h 后形成單一色氨酸，該過程步驟繁瑣、耗時長、勞動強度大且處理過程中色氨酸易損失［17］。微波水解的過程： 樣品水解液在超高頻電磁波作用下［18］，極性分子隨微波頻率快速變換取向，分子之間高速碰撞摩擦［19-20］，在密閉環境中迅速加熱水解，不但克服了常規水解法缺陷，而且氨基酸的化學形式不變［21-22］，提高了反應速度和靈敏度。 該加熱方式與傳統的加熱方式相比具有操作簡單、樣品水解快、節約能源、工作效率高和勞動強度小等優點［23-24］。 因此，研究微波堿水解法快速測定飼料色氨酸含量，有助于提高檢測效率。

表5 飼料色氨酸回收率測定結果

表6 微波堿水解法與國標常規堿水解法TMR 色氨酸含量對比

4 結論

①測定飼料中色氨酸含量的最佳微波堿水解條件：水解溫度170 ℃，水解時間30 min，堿濃度5 mol/L； 水解溫度是影響飼料色氨酸含量的最主要因素。

②結合氨基酸自動分析儀鈉離子流動相系統測定TMR 飼料中色氨酸含量為0.14%。 該方法線性關系良好，方法回收率和樣品精密度較高。