一種四環吲哚衍生物降血糖和降血脂活性評價與作用機制

張夢迪，彭小林，吳 巖，韓開林，劉 振，孫 華

(天津科技大學生物工程學院，天津300457)

糖尿病是人類生活中最常見的代謝性疾病之一，以高血糖和高脂血癥為主要特征，并伴隨多種并發癥，包括神經病變、腎病、心臟病、中風和血管疾病[1].2 型糖尿病約占糖尿病患病人數的90%以上，其病因是胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起的血糖升高[2].目前治療2 型糖尿病的口服藥物有α–葡萄糖苷酶抑制劑、磺脲類、噻唑烷二酮類、二甲雙胍和中成藥等.α–葡萄糖苷酶通過水解低聚糖的1，4–α–糖苷鍵釋放葡萄糖，是消化碳水化合物過程的最后一步.α–葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制小腸黏膜刷狀緣的α–葡萄糖苷酶活性，減緩低聚糖和二糖中葡萄糖的釋放，從而降低餐后血糖水平，延緩葡萄糖吸收[3–4].磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)抑制合成代謝過程，刺激產生能量的分解代謝過程，降低血糖水平[5].AMPK活化也會抑制乙酰輔酶A 羧化酶(ACC)活性和丙二酰輔酶A 的產生，從而抑制脂肪合成和刺激脂肪酸氧化.

四環吲哚衍生物是一類代表性的生物堿，廣泛存在于植物和微生物代謝產物中，具有多種生物活性[6–7].本課題組曾經報道了一系列新型四環吲哚衍生物的合成以及抑制α–葡萄糖苷酶活性的研究[8–9].其中，四環吲哚衍生物化合物7i 具有較強的α–葡萄糖苷酶抑制活性，但其作用機制以及體內是否具有降血糖和降血脂活性尚不清楚.因此，本研究旨在探討化合物7i 能否改善糖尿病小鼠的高血糖和高血脂等癥狀，并進一步研究該化合物的抑制α–葡萄糖苷酶作用機制以及其他可能的作用靶點.

1 材料與方法

1.1 材料

化合物7i(圖1)由天津科技大學藥物設計與合成研究室合成(純度＞95%)[10].

圖1 化合物7i的結構Fig. 1 Structure of compound 7i

來源于酵母的α–葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)、對硝基苯基–α–D–吡喃葡萄糖苷(pNGP)、4，4′–二苯胺–1，1′–聯萘–5，5′–二磺酸二鉀鹽(Bis-ANS)、油紅O溶液、3–異丁基–1–甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、油酸、棕櫚酸、亞油酸、花生四烯酸、阿卡波糖，Sigma-Aldrich 公司；透析袋(MD 34-3.5-5)、DAPI 染料，北京索萊寶生物科技有限公司；人肝癌細胞HepG2、前脂肪細胞3T3-L1，中國科學院上海生物科學研究所；胰島素，諾和諾德(中國)制藥有限公司；洛伐他汀(10μmol/L)，南京草本源生物科技有限公司；anti-p-AMPKα(Thr172) 、AMPKα、p-ACC(Ser79)、ACC 和β-actin 的抗體，Cell Signaling Technology 公司；5–氨基–1–[(2 R，3 R，4 S，5 R)–3，4–二羥 基–5–(羥 甲 基)惡 唑–2–基]咪 唑–4–甲 酰 胺(AICAR)，安諾倫生物科技有限公司；甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)測試試劑盒，北京普利萊基因技術有限公司；鏈脲霉素(STZ)，北京博愛港商貿有限公司.

1.2 體內活性評價

1.2.1 動物與飲食

體質量18～22 g 的雄性昆明小鼠購自中國農業科學院實驗動物科學研究所( 許可證號為SCXK(Jun)2012–0004).該動物實驗嚴格按照國家和當地的倫理準則執行.小鼠每籠5 只，在實驗室條件下(18～23 ℃，濕度 55% ～60% ，光/暗周期為12 h/12 h)進行飼養.所有小鼠均以普通顆粒飼料喂養1 周后隨機分組，正常組(10 只)的小鼠繼續用普通飼料喂養，其余小鼠用高糖高脂飼料喂養(模型組和給藥組).所有的小鼠均自由飲食.

1.2.2 2 型糖尿病小鼠的誘導及治療

STZ 溶于 0.05 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液中(pH 4.5)，小鼠單次腹腔注射上述STZ 溶液誘導2 型糖尿病，并連續高糖高脂飼料輔助喂養2 周，小鼠的尾靜脈空腹血糖高于11.0 mmol/L，即2 型糖尿病小鼠造模成功.將造模成功的2 型糖尿病小鼠分為4 組，每組10 只.第1 組灌胃生理鹽水10 mL/kg(模型組)；第2 組灌胃阿卡波糖(溶解于生理鹽水)55 mg/kg；第3 和4 組分別灌胃給藥7i(懸浮于生理鹽水中)55 mg/kg 和100 mg/kg[11].

1.2.3 血糖水平的測定

各組小鼠灌胃給藥或生理鹽水14 d 后，隔夜禁食，口服葡萄糖(2 g/kg)，于0、30、60 和120 min 從尾靜脈采集血樣，血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)測量血糖[11].

1.2.4 血脂水平的測定

在實驗期結束時，眼內眥取血，1000 r/min 離心獲得血清，-20 ℃儲存.血清總膽固醇和甘油三酯使用試劑盒進行分析.

1.2.5 肝臟組織學評價

小鼠麻醉處死，獲取胸腺、脾、胰、肝，組織用冷生理鹽水沖洗，稱量.肝臟用4%多聚甲醛溶液室溫下過夜固定，用石蠟包埋，42 ℃干燥48 h，二甲苯脫石蠟，梯度乙醇復水，蒸餾水清洗后，用蘇木精復染切片.隨后用自來水、醋酸和雙蒸水沖洗切片，在乙醇和甲苯中脫水并用中性膠密封.

1.3 體外活性評價

1.3.1 酶動力學

在磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 6.8)中加入α–葡萄糖苷酶(400μL，0.01 U/mL，2 組)，其中一組用7i(20μmol/L) 處理的α– 葡萄糖苷酶(400μL ，0.01 U/mL)在4 ℃下透析24 h，測定透析袋中殘余酶活性，另一組α–葡萄糖苷酶經7i 處理30 min 后直接測定酶的活性[10].

1.3.2 酶內源熒光影響

α–葡萄糖苷酶(1 U)經一定濃度的 7i(0 ～500μmol/L)在37 ℃預處理30 min，用M200PRO 型熒光分光光度計(Tecan 公司)在295 nm 激發波長下測定320～400 nm 范圍內的內源熒光光譜[12].

1.3.3 酶結合區域分析

α–葡萄糖苷酶(1 U)與一定濃度的 7i(0 ～50μmol/L)在37 ℃溫孵30 min，添加熒光探針(Bis-ANS，30μL，100μmol/L)后，在 37 ℃下再孵育15 min，使用Synergy H1 型微板分光光度計(美國BioTek 公司)測量430～630 nm 范圍內的熒光光譜(λex＝400 nm)[12].

1.3.4 人肝癌細胞HepG2 培養及誘導

HepG2 細胞在含有 10% 胎牛血清(FBS)、10 U/mL 青霉素和10 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基中置于37 ℃、5% CO2培養箱培養.將HepG2 細胞接種于6 孔板上培養24 h，正常組不加誘導劑，模型組和給藥組分別加入0.75 mmol/L 的誘導劑(油酸、棕櫚酸、亞油酸和花生四烯酸的體積比為29∶47∶18∶6)處理，且給藥組加入不同濃度的化合物7i[13].

1.3.5 前脂肪細胞3T3-L1 培養與分化

前脂肪細胞3T3-L1 在添加10%新生小牛血清和1%青霉素–鏈霉素的DMEM 培養基中置于37 ℃、5% CO2培養箱培養.為了進行脂肪細胞分化，將前脂肪細胞3T3-L1 培養2 d 后，模型組和給藥組加入分化培養基(含 10% 胎牛血清、0.5 mm IBMX、1μmol/L 地塞米松和10μg/mL 胰島素)，2 d 后更換含有10%胎牛血清和10μg/mL 胰島素的DMEM 分化培養基，繼續孵育2 d 后給藥[14–15].

1.3.6 油紅O 染色法測定脂含量

將給藥處理后的人肝癌細胞HepG2 和前脂肪細胞3T3-L1 用油紅O 染色，4%多聚甲醛固定30 min，1×PBS 沖洗3 次.用異丙醇提取細胞內結合的油紅O，并在492 nm 處測量吸光度，計算細胞內脂含量[14].

1.3.7 尼羅紅染色法分析脂含量

將尼羅紅溶解在1 mg/mL 丙酮中.HepG2 細胞接種在6 孔板上，給藥處理24 h 后，分別加入到終質量濃度10μg/mL 的尼羅紅和1μg/mL DAPI 染料，室溫黑暗條件下孵育15 min，使用倒置熒光顯微鏡進行拍照[14].

1.3.8 細胞內甘油三酯和總膽固醇的測定

將HepG2 和3T3-L1 細胞接種在6 孔板上，誘導分化后給藥處理24 h，用1×PBS 洗3 次，離心收集細胞，用TG 和TC 試劑盒中裂解液裂解細胞，室溫保存 10 min，對細胞內蛋白質進行定量分析，在70 ℃加熱細胞10 min 后，2 000 r/min 離心5 min，使用試劑盒分析TG 和TC 含量[13].

1.3.9 免疫印跡分析

HepG2 和3T3-L1 細胞在60 mm 培養皿中以每孔1×105個細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h，正常組不加誘導劑處理，模型組和給藥組加入誘導劑(油酸、棕櫚酸、亞油酸和花生四烯酸的體積比為29∶47∶18∶6)處理.給藥組加7i 處理24 h 加入胰蛋白酶消化收集細胞，細胞用1×PBS 洗滌3次，2 500 r/min 離心5 min，加入蛋白裂解液，在冰上裂解60 min，4 ℃、13 500 r/min 離心20 min.用BCA蛋白質分析試劑盒測定蛋白質含量，使用等量的蛋白質溶液在十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠(SDSPAGE)進行電泳，電泳完成后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上.PVDF 膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉 1 h，用不同的一抗 p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC 和β-actin 與PVDF 膜4 ℃孵育過夜，PVDF 膜用1×PBS 清洗3 次，與鼠抗或兔抗(1∶5 000 稀釋度)在室溫下孵育2 h 后，ECL-Western-Blotting 底物(Thermo-Scientific 公司)檢測條帶[14].

1.4 統計分析

所有數據以“均值±標準差”表示，結果采用單因素方差(ANOVA)或雙向檢測(two tailed independent Student’s t-tests)進行分析，顯著性差異用SPSS 21.0 軟件進行方差齊性檢驗和最小顯著性差異(LSD)多重比較確定.

2 結果與討論

2.1 化合物7i對體質量的影響

化合物7 i 對小鼠體質量的影響如圖2 所示.經過1 周正常喂養，各組小鼠的初始體質量無顯著性差異.高糖高脂飼料喂養3 周后，模型組的體質量顯著增加.模型組單次腹腔注射STZ 后，繼續喂養高糖高脂飼料喂養2 周，模型組體質量有所減輕，出現糖尿病小鼠的癥狀.2 型糖尿病組口服灌胃化合物7i 和阿卡波糖.給藥2 周后，與2 型糖尿病模型組相比，7i 給藥組體質量沒有明顯變化.結果表明：7i 對糖尿病小鼠體質量無明顯影響，與阿卡波糖作用效果相似.

圖2 化合物7i對體質量的影響Fig. 2 Effect of 7i on body weight

2.2 化合物7i對血糖和口服葡萄糖耐量的影響

化合物7i 對血糖和口服葡萄糖耐量的影響如圖3 所示.以55 和100 mg/kg 劑量的7i 給藥后，糖尿病小鼠的空腹血糖水平顯著降低(aP＜0.05、bP＜0.01、cP＜0.001 表示與模型組比較，dP＜0.001 與正常對照組比較).為了評價化合物7i 對糖尿病小鼠的葡萄糖穩態和胰島素敏感性的影響，進一步進行了葡萄糖耐量的測試.

圖3 化合物7i對血糖和口服葡萄糖耐量的影響Fig. 3 Effect of 7i on blood glucose and on oral glucosetolerance in diabetic mice

與模型組相比，口服葡萄糖后，7i 的55 mg/kg 劑量組在30、60、90 和120 min 的血糖濃度分別降低11.06%、10.27%、10.37%和11.08%.從曲線下面積圖可以看出，與模型組相比，阿卡波糖組和化合物7i均能顯著改善葡萄糖耐量(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001).

2.3 化合物7i對糖尿病小鼠器官的影響

分別對各組的胸腺、脾、胰、肝臟臟器指數進行分析，結果發現只有肝臟臟器指數發生顯著變化.口服7i 可顯著改善肝臟臟器指數的增加.進一步對肝臟進行組織學染色分析，結果如圖4 所示.

圖4 不同組小鼠肝臟蘇木精染色Fig. 4 Haematoxylin staining of different groups of mice liver

經蘇木精染色后，發現正常組肝細胞形態正常，肝細胞索排列整齊.模型組肝細胞出現嚴重的病理改變，具有肝索紊亂、水腫變性和脂肪變性的特征.阿卡波糖給藥組肝細胞恢復效果較差，而7i 給藥組的肝細胞出現良好的恢復現象，尤其是給藥100 mg/kg 劑量組，肝細胞結構與正常肝細胞結構相似，水樣變性和脂肪變性得到顯著恢復.因此，對于改善糖尿病小鼠的肝臟病變，相同劑量下，化合物7i治療效果優于阿卡波糖.

2.4 化合物7i對血脂的影響

化合物7i 對血脂的影響見表1.STZ 誘導后糖尿病小鼠組血清TC 和TG 較正常組顯著升高，而7i治療的糖尿病小鼠，TC 和TG 水平顯著下降.因此，化合物7i 可以顯著改善糖尿病小鼠的高血脂癥狀.

表1 甘油三酯和總膽固醇含量(n＝10)Tab. 1 Levels of TC and TG in each group of mice(n＝10)

2.5 α–葡萄糖苷酶的動力學性質分析

利用透析方法，對化合物7i 抑制α–葡萄糖苷酶的動力學性質進行了分析，結果如圖5 所示(與酶透析組相比，**P＜0.01).經化合物7i 處理的α–葡萄糖苷酶，透析后活性不能恢復，與未經透析的7i 處理的α–葡萄糖苷酶活性相似，這表明7i 對α–葡萄糖苷酶的抑制方式是不可逆的.

圖5 化合物7i處理下透析或非透析后α-葡萄糖苷酶活性Fig. 5 α-Glucosidase activity after dialysis or non-dialysis in presence of DMSO or 7i

2.6 化合物7i猝滅α–葡萄糖苷酶的內源熒光

使用熒光猝滅實驗研究了化合物7i 與α–葡萄糖苷酶的相互作用，結果如圖6 所示.α–葡萄糖苷酶在295 nm 激發波長下，在336 nm 處出現內源熒光吸收峰.經不同濃度7i 處理后，α–葡萄糖苷酶的內源熒光強度隨著化合物7i 濃度的增加而逐漸減弱，該結果為化合物7i 直接與α–葡萄糖苷酶結合提供了證據.這種結合可能導致α–葡萄糖苷酶中色氨酸殘基的構象變化，進而影響酶活性中心與底物的結合.

圖6 不同濃度7i對α–葡萄糖苷酶內源熒光強度的影響Fig. 6 Variation of the intrinsic fluorescence intensity of α-glucosidase in the absence and presence of different concentrations of 7i

2.7 化合物7i與α–葡萄糖苷酶疏水區域的結合

利用外源熒光疏水探針bis-ANS 進一步研究化合物7i 與α–葡萄糖苷酶表面疏水性區域的結合情況.該熒光探針與α–葡萄糖苷酶共孵育時，在430～630 nm 范圍內可以觀察到強烈的熒光信號(圖7).經不同濃度的7i 處理后，酶與熒光探針的復合物的熒光強度呈濃度依賴性明顯降低.該結果說明化合物7i 可能與酶的疏水區域結合，并競爭性抑制了α–葡萄糖苷酶的表面疏水性與熒光探針的結合.

圖7 不同濃度7i 對α–葡萄糖苷酶與熒光探針復合物的熒光光譜的影響Fig. 7 Fluorescence spectra of α-glucosidase-bis-ANS complex in the absence and presence of different concentrations of 7i

2.8 化合物7i抑制HepG2和3T3-L1細胞中TG和TC的積累

以HepG2 和3T3-L1 細胞為模型，進一步研究化合物7i 對脂質代謝的影響，結果如圖8 所示(與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001).

誘導劑處理24 h 后細胞內TG 和TC 含量顯著增加，加入不同濃度的 7i 和陽性對照洛伐他汀10μmol/L 后，HepG2 和3T3-L1 細胞中的TG 和TC水平呈劑量依賴性降低.此外，利用倒置熒光顯微鏡，用尼羅紅和DAPI 染色也能直觀地觀察到HepG2的脂質含量隨著7i 劑量依賴性的降低(圖9).

圖8 化合物7i對HepG2和3T3-L1細胞的脂質代謝的影響Fig. 8 Compound 7i reduced lipid accumulation in HepG2 and 3T3-L1 cells

圖9 對HepG2細胞的尼羅紅和DAPI染色Fig. 9 Nile red and DAPI staining of HepG2 cells

2.9 化合物7i對AMPK通路相關蛋白的影響

由于AMPK 通路在脂質代謝過程中起著關鍵性作用，因此進一步測定了7i 對AMPK 通路相關蛋白表達量的影響，結果如圖10 所示(與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001).以AICAR(250μmol/L)為陽性對照，實驗結果表明，化合物7i 能夠顯著上調AMPK(Thr172)和ACC(Ser79)蛋白的磷酸化水平，與AMPK 激活劑AICAR 作用效果相似.

圖10 化合物7i通過AMPK-ACC級聯減少HepG2和3T3-L1細胞中的脂質積聚Fig. 10 Compound 7i reduces the lipid accumulation via AMPK-ACC cascade in HepG2 and 3T3-L1 cells

該結果表明，化合物7i 可能通過上調AMPK 通路中AMPK 和ACC 磷酸化而起到降脂的作用.

3 結 論

本研究評價了化合物7i 對糖尿病小鼠的體內降血糖和降血脂作用，以及體外抑制α–葡萄糖苷酶機制，細胞水平降脂活性和初步針對AMPK 通路的調節活性和機制.在糖尿病小鼠中，55 和100 mg/kg 劑量的化合物7i 顯著降低餐后血糖水平，并明顯改善葡萄糖耐量.化合物7i 還能明顯抑制血清TC 和TG水平的升高，并改善肝臟臟器指數，使肝細胞恢復正常.化合物7i 可能與α–葡萄糖苷酶輸水區域直接結合，不可逆抑制酶的活性而達到降血糖的作用.此外，7i 能夠降低HepG2 和3T3-L1 細胞中TG 和TC的積累，其機制可能是通過上調AMPK 和ACC 的磷酸化水平而達到降低血脂和血糖的作用.因此，化合物7i 作為α–葡萄糖苷酶抑制劑和AMPK/ACC 信號調節劑雙重調節糖脂代謝紊亂，為其發展成為新型抗糖尿病藥物提供基礎支持.