TET蛋白家族與5-羥甲基胞嘧啶在干細胞及再生醫學表觀遺傳調控中的作用

趙健芳，李 東，安 陽△

(1.北京大學第三醫院成形外科，北京 100191； 2.北京大學第一醫院整形燒傷外科，北京 100034)

表觀遺傳調控是對DNA及組蛋白的修飾，決定了何時、何地、以何種方式對遺傳信息進行表達[1]。DNA甲基化是目前研究最多的表觀遺傳調控方式之一[2]，將一個甲基共價結合在DNA胞嘧啶的5-碳位置上形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)。過去人們曾認為DNA甲基化是一個不可逆的過程，只能通過DNA復制過程來被動稀釋，但近年來對TET(ten eleven translocation)蛋白的研究發現，TET蛋白家族可以催化5mC氧化生成5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine, 5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine, 5caC)， 從而消除DNA甲基化印記，促進“主動”DNA去甲基化過程[3]。隨著組織工程技術的發展，器官移植、自體組織移植及人工假體已經廣泛應用于臨床治療當中，但這些技術都存在局限性，而應用干細胞及干細胞相關因子進行治療的再生醫學則為解決這些問題提供了新的思路[4]。脂肪干細胞 (adipose-derived stem cell, ADSCs)有著可大量獲取、易于進行基因調控、且沒有倫理學爭議等優點[4]，但迄今為止，調控ADSCs增殖及多向分化的分子生物學機制仍不甚清晰。目前已有一些研究探尋表觀遺傳調控及TET蛋白在胚胎干細胞中的作用，但其在ADSCs中所知甚少。本文簡要介紹了TET蛋白家族及5hmC的結構及功能，總結了近年來TET蛋白及5hmC在哺乳動物干細胞中的研究進展，并探索其在ADSCs及再生醫學中的潛在應用。

1 DNA甲基化、去甲基化與TET蛋白家族

DNA甲基化是最早發現的DNA表觀遺傳調控方式之一，其在基因表達調控和細胞分化過程中起著重要作用[5]。隨著細胞分化，多能基因被表觀遺傳沉默，而組織特異性基因則表達的更加活躍。在早期胚胎發育過程中，DNA甲基化模式會被清除，直到胚胎著床、器官發育之前才重新建立[6]，而異常的DNA甲基化水平則會導致腫瘤的發生[7]。很長一段時間以來，人們認為DNA甲基化是一個不可逆的調控過程，只能通過DNA復制來減少，但最近一些研究發現，TET蛋白家族可能通過修飾5mC來調控DNA去甲基化過程，從而使已經沉默的基因恢復表達。TET蛋白家族可以氧化5mC形成5hmC、5fC以及5caC，而這些氧化產物同時也是5mC去甲基化過程中的重要中間體[8-9]。很多研究表明，5hmC表達水平與基因表達調控、多能干細胞分化、神經元發育,以及腫瘤發生密切相關[10]，因此，TET蛋白家族很有可能介導了DNA去甲基化過程的第一步。TET蛋白生物功能的發現使人們對DNA去甲基化過程有了全新的認識，并提示DNA甲基化是一個動態可逆的過程。

2 TET蛋白家族的基本結構及作用

人TET蛋白家族包含TET1、TET2和TET3三個成員，所有TET蛋白都包含一個保守的雙鏈β-螺旋結構域、一個富含半胱氨酸區和C端的核心催化結構域[11]。催化結構域內則包含α-酮戊二酸(alpha-ketoglutaric acid, α-KG)和Fe2+的結合位點，使TET蛋白具有雙加氧酶活性[11]。除了共有結構，TET1和TET3還具有一個N端的CXXC鋅指結構域，可與特定的DNA序列結合(圖1)。TET1最早是在研究有t(10; 11)(q22; q23)異位的急性髓細胞性白血病(acute myeloid leukemia, AML)時被發現的[12]。2009年，Tahiliani等[8]發現TET1具有催化5hmC羧基化的酶活性，并且證實TET1與5hmC的產生和表達水平直接相關。在這之后，3種TET蛋白都被證實具有將5mC氧化為5hmC的功能[13]。雖然3種TET蛋白具有相對保守的催化結構域，但它們在生物體中的作用基本不重復，并且表達具有顯著的細胞/器官特異性，其中TET1主要在胚胎干細胞(embryonic stem cell, ESCs)中表達，TET2主要在造血系統中表達，TET3則在小腦、皮質和海馬體等神經系統中廣泛表達[14]。

The carboxyl terminal core catalytic domain is highly conserved in all TET family members and consists of double-stranded β-helix domain and Cys-rich domain. The double-stranded β-helix domain contains binding sites of α-ketoglutaric acid and Fe2+. TET, ten eleven translocation protein.圖1 TET蛋白的結構域Figure 1 Structure domain of TET protein

3 5hmC與TET蛋白在DNA去甲基化中的作用

5hmC最早是由Wyatt等[15]在大腸桿菌噬菌體核酸內發現的。2009年，Kriaucionis等[16]和Globisch等[17]發現5hmC在小鼠所有組織和細胞中均有不同程度的表達，并且在中樞神經系統內表達最高，提示了5hmC在表觀遺傳調控神經元功能中的作用。與此同時，另一項突破性的研究發現TET1蛋白可以將5mC氧化成5hmC，而5hmC的表達水平會隨著TET1的敲除而下降[8]。除了催化5mC羥基化生成5hmC，TET蛋白還可以將5hmC進一步氧化成5fC和5caC[9]。通過調控這些堿基的分布與含量，TET蛋白直接或間接地參與了DNA去甲基化過程。DNA去甲基化包括“被動”和“主動”兩種形式。“被動”的DNA去甲基化是指在細胞分裂和DNA復制的過程中，5mC不斷稀釋，從而無法維持原有的DNA甲基化模式，而TET蛋白介導的5hmC沉積則可以誘導“被動”DNA去甲基化，并逆轉異常的DNA甲基化突變。“主動”的DNA去甲基化則是指在酶的誘導催化下，5mC和其他氧化堿基被切除，重新由未修飾的胞嘧啶替換的過程。胸腺嘧啶-DNA糖基化酶(thymine-DNA glycosylase, TDG)和堿基切除修復(base excision repair, BER)主要介導這一過程。TDG雖然不能識別5hmC，但它可以識別5hmC被TET氧化后的產物5fC和5caC并將其切除，然后再由BER將未修飾的胞嘧啶替換上去[18]。也就是說，TET蛋白及5hmC在DNA去甲基化過程中起著不可或缺的作用(圖2)。

TET protein oxidizes 5mC into 5hmc, 5fC and 5caC, of which 5fC and 5caC are directly removed by thymine-DNA glycosylase. Through base excision repair, the resulting base sites are replaced by unmethylated cytosine. TET, ten eleven translocation protein; 5mC, 5-methylcytosine; 5hmC, 5-hydroxymethylcytosine; 5fC, 5-formylcytosine; 5caC, 5-carboxylcytosine.圖2 TET蛋白在被動和主動DNA去甲基化中的作用Figure 2 Role of TET protein in passive and active DNA demethylation

4 5hmC與TET蛋白在維持干細胞多能性及胚胎發育中的作用

DNA甲基化在干細胞增殖分化過程中起著重要作用[19]。TET蛋白和5hmC可以調控DNA去甲基化過程，因此它們可能參與維持干細胞多能性和調控胚胎發育。一些研究表明，5hmC在自我更新的干細胞和多能干細胞內表達水平較高，而隨著細胞分化其表達水平顯著降低[17, 20]。對小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)含5hmC的DNA進行的高通量測序結果顯示，5hmC在外顯子內和轉錄起始點附近高度聚集，提示了5hmC在調控轉錄激活中的作用[21]。另外，在mESCs和誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)內，不僅存在5hmC富集，TET1和TET2表達水平也相對較高。敲除TET1和TET2則會導致一些干細胞多能性相關基因的表達下調，而隨著mESCs不斷分化，TET蛋白表達水平下降，同時伴有胚胎干細胞特異性基因啟動子區的甲基化水平升高和基因沉默[13, 22]。這些研究都表明，5hmC不僅是一個DNA去甲基化過程的中間產物，還可能作為穩定的表觀遺傳印記，參與維持干細胞多能性的過程。另外，有研究在敲除了全部三種TET蛋白的mESCs內觀察到端粒姐妹染色體交換和端粒延長的現象，說明TET蛋白不僅可以通過使啟動子區低甲基化來維持轉錄活躍基因的持續表達，還可以通過調節端粒穩態來調控干細胞的分化[23]。

5 5hmC與TET蛋白在脂肪干細胞及組織工程中的應用

5.1 脂肪干細胞在組織工程及再生醫學中的應用

隨著組織工程技術和再生醫學的發展，使用干細胞進行組織器官的修復再生為整形外科的臨床治療提供了新的思路。干細胞主要包括三種：ESCs、iPSCs和成人干細胞，其中ESCs和iPSCs有著極強的自我再生能力和多能性，但這些細胞在技術層面較難調控，而且涉及倫理學問題，而成人干細胞即有免疫相容性，又沒有倫理學擔憂，從而得到了廣泛研究。在所有種類的成人干細胞中，ADSCs因其廣泛存在、容易被大量獲取、且獲取時對患者造成的傷害很小，而成為目前最有前景的干細胞群之一[4]。

ADSCs有著很強的增殖能力和多向分化能力[24-25]，還可以分泌大量細胞因子和生長因子，對人體組織和器官的生長分化起到促進作用[26]。正是由于ADSCs具有這些優勢和特性，越來越多的學者開始探索ADSCs在再生醫學細胞/組織治療中的應用。Yoshimura等[27]研發了一種細胞輔助脂肪移植術(cell-assisted lipotransfer, CAL)， 使用提純過的含有自體ADSCs的基質血管成分(stromal vascular fraction, SVF)用于脂肪注射隆胸術，結果表明，應用CAL技術的患者術后2個月注射脂肪的萎縮量更少，患者滿意率更高。基于ADSCs的組織工程技術在骨缺損再生修復中的應用也得到了廣泛研究。有研究歸納了近年來學者們使用ADSCs治療顱頜面骨缺損的病例報告和臨床試驗，并總結了這種新方法的優缺點[28]。ADSCs在傷口修復愈合過程中也起著重要作用[29-30]。將成纖維細胞及增生性瘢痕組織培養在含ADSCs的培養基上，可以顯著減少膠原沉積和瘢痕形成[31]。綜上所述，大量研究已經證明了ADSCs在再生醫學和組織工程學中的重要作用，它將為臨床醫學各領域探究新的治療方法提供廣闊思路。

5.2 5hmC與TET蛋白在脂肪干細胞增殖分化中的作用

相較于DNA去甲基化在ESCs中的廣泛研究，人們對于該過程在成人干細胞多能性維持和細胞分化中的作用及分子機制仍所知甚少。近年來的一些研究指出，DNA去甲基化可能在ADSCs分化過程中也起著重要作用。使用DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferase, DNMT)抑制劑5-氮雜胞苷(5-azaytidine, 5-AZA)誘導ADSCs，可以降低ADSCs內DNA甲基化的程度，顯著增強多能性基因的表達，從而誘導ADSCs的肝細胞樣分化[32]以及成肌分化[33]。另有研究表明，在ADSCs成骨分化的終末期發生著非常活躍的DNA去甲基化[34]，且5-AZA可以增強ADSCs成骨分化的能力[35]。

TET蛋白和5hmC是DNA去甲基化過程中的關鍵調控因子。有研究表明，5mC含量減少和5hmC含量增加是ADSCs成骨分化過程中的關鍵事件，并且伴隨著TET1表達的增加[36]。另外，5-AZA可以通過減少5mC、增加5hmC、誘導TET2和TET3基因表達，來降低DNA甲基化程度，減少氧化應激因子聚集，增強細胞增殖能力，進而逆轉ADSCs的退行性變化[37]，提升已老化ADSCs的成骨分化潛能[35]。有研究聯合使用白藜蘆醇(resveratrol, RES)和5-AZA，進一步證明了使用5-AZA/RES可以通過調控DNA去甲基化從而改善ADSCs功能失調，并且這種作用可能與線粒體動態變化及細胞自噬有關[38-39]。另外在脂肪形成過程中，TET1和TET2基因表達水平隨前脂肪細胞成脂分化而逐漸升高，進而引起以5mC減少和5hmC增加為標志的DNA去甲基化[40]。TET蛋白還可以通過引起區域性去甲基化，促進脂肪特異性基因表達，從而介導脂肪細胞的分化[41-42]。這些研究提示了TET蛋白及5hmC在ADSCs增殖分化過程中的潛在作用，對于基于ADSCs的再生醫學臨床治療有著重要意義，但其機制仍需進一步探究。

6 研究意義及展望

自TET蛋白家族發現起，已經有大量研究證明它們在DNA去甲基化過程中起著關鍵作用。干細胞增殖及分化過程離不開表觀遺傳調控及DNA甲基化，目前已有少量研究提出TET基因表達及5hmC含量增加可能是ADSCs自我更新及多向分化過程中的重要事件[35-42]，而ADSCs正是再生醫學干細胞治療領域最有應用前景的干細胞譜系之一。可以想見，對TET蛋白及5hmC在ADSCs中的作用進行研究，將完善干細胞治療的理論基礎，強有力推動再生醫學的發展，但目前這一研究領域尚存在很多問題亟待解決，首先，比起圍繞ADSCs進行的大量基礎研究，現有的針對ADSCs臨床應用的臨床試驗樣本量都較小，涵蓋的領域和疾病種類也較少，仍需大量的臨床研究來證實ADSCs在疾病治療及組織器官再生修復中的臨床價值；其次，ADSCs的增殖分化能力與ADSCs的獲取位置、宿主年齡及細胞傳代數密切相關，然而人們對于調控這些現象的關鍵因素仍不清楚；再次，目前尚無研究證實TET蛋白與ADSCs增殖分化的直接關系，更不論其中可能存在的分子生物學機制，但即便存在著若干問題亟待解決，不可否認的是ADSCs因其諸多優勢，已經在再生醫學領域受到了廣泛關注，而TET蛋白家族作為調控DNA表觀遺傳調控的關鍵因子，其在ADSCs中的潛在作用機制將為人們理解ADSCs的增殖分化及干細胞療法的臨床應用提供全新的思路。在未來，結合生物打印技術，ADSCs可能應用于組織器官再生、整形外科重建等更廣闊的領域。