生物活性玻璃對人臍靜脈血管內皮細胞增殖及成血管的作用

黃麗東，宮瑋玉，董艷梅

(北京大學口腔醫學院·口腔醫院，牙體牙髓科 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室 口腔數字醫學北京市重點實驗室， 北京 100081)

生物材料具有生物活性和生物降解性，能夠刺激骨細胞產生應答反應，在誘導骨組織再生的同時被機體吸收，使缺損部位為新骨取代，因而作為植骨材料廣泛應用于骨組織工程中[1-4]。然而，當用生物材料修復較大范圍骨缺損時，常會出現新生組織的形成在外周區域多而中心區域缺乏的現象，究其原因主要是由于材料內部新生血管不足、中心部位缺血、組織無法獲得持續的養分和氧氣供給，使得新生組織無法形成或發生壞死[5]。在生物材料上植入血管內皮細胞、載荷促血管生長因子等方式可促進血管形成，但存在內皮細胞取材、培養和擴增周期長，生長因子在體內半衰期短等問題，無法達到理想的效果，因此，有必要尋找一種生物活性材料，具有良好的成骨作用，同時能夠誘導血管內皮細胞向骨缺損區域和材料內部遷移，在骨缺損愈合過程中形成同步的再血管化。

生物活性玻璃具有良好的生物活性和骨誘導性，在臨床應用中取得了較好的治療效果[3, 6-9]。與羥基磷灰石、磷酸三鈣等材料相比，生物活性玻璃具有骨誘導作用，能夠刺激周圍的間充質干細胞向成骨細胞分化，不僅支持新骨在骨-材料界面生長，還能誘導骨組織在材料內部、遠離骨-材料界面的部位生長[10]。在成血管方面，生物活性玻璃及其離子溶出物能夠促進成纖維細胞分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等血管源性生長因子[11]，誘導內皮細胞向骨缺損區域和材料內部遷移、增殖[12-13]，形成脈管系統。體內研究[14-17]也表明，生物活性玻璃涂層復合材料具有促進血管生成的能力，但在一些研究中，生物活性玻璃未能表現出促進血管生成的作用，可能與材料的制備工藝、形貌結構及材料濃度等因素有關[18-20]。

隨著制備工藝的改進與發展，生物活性玻璃的生物活性不斷提高。溶膠-凝膠法制備的生物活性玻璃，顆粒形態和大小可控，比表面積增大，較第一代熔融法制備的45S5生物活性玻璃具有更高的生物活性[21]。以植酸為前驅體制備的生物活性玻璃(phytic acid derived bioactive P2O5-SiO2-CaO gel-glasses, PSC)，是一種采用溶膠-凝膠法制備、具有我國自主知識產權的的新型生物活性玻璃，由中國科學院化學研究所制備[22]。植酸(分子式C6H18O24P6)是一種從植物種籽中提取的有機磷酸化合物，較傳統的磷前驅體毒性小，且可使玻璃的制備過程不再需要400～600 ℃煅燒，提高了材料的生物相容性和生物活性。用PSC制備的可注射型復合骨水泥應用于兔股骨缺損修復，能夠顯著促進骨組織再生[23]，顯示PSC在骨組織修復領域具有較好的應用前景。然而，PSC在成血管方面是否具有良好的作用尚未得到證實，因此，本研究旨在觀察PSC對人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)增殖、血管生長因子表達及體外成血管作用的影響，為PSC進一步應用于骨組織工程奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

主要試劑與材料：HUVECs購自美國ScienCell公司，達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青霉素/鏈霉素混合液、內皮細胞生長因子購自美國ScienCell公司，胰蛋白酶購自美國Gibco公司，甲基噻唑基四唑溶液[(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]購自美國Sigma公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，FastStart Universal SYBR Green Master反轉錄試劑盒購自美國Roche公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自美國Ameresco公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司，活細胞染色試劑盒購自美國Sigma公司，細胞培養皿等耗材購自美國Corning公司。

主要設備：酶標儀(ELX808)購自美國BioTek公司，實時定量PCR儀(StepOne Plus)購自美國ABI公司，倒置相差顯微鏡(Ts100)購自日本Nikon公司。

1.2 細胞培養

原代HUVECs培養于內皮細胞培養基(endothelial cell medium, ECM)， 培養基成分(體積分數)為DMEM(93%)+FBS(5%)+內皮細胞生長因子(1%)+青霉素/鏈霉素(1%)， 置于37 ℃、5%(體積分數)CO2恒溫培養箱中培養。每2～3天換一次培養基，待細胞達80%～90%融合時消化傳代，取5～7代細胞用于實驗。

1.3 PSC浸提液的制備

PSC由中國科學院化學所邱東教授實驗室制備[22]，化學組成(質量分數)為P2O5(22.7%)、SiO2(48.2%)、CaO(29.1%)，顆粒為無規則形態，平均粒徑為(21±12) μm，比表面積為53.5 m2/g。

PSC浸提液的制備是將PSC粉末置于180 ℃恒溫箱中高溫干熱滅菌4 h后，加入ECM，在37 ℃水平搖床中以100 r/m浸提24 h，用0.22 μm濾器過濾除菌，再加入5%FBS、1%內皮細胞生長因子和1%青霉素/鏈霉素制備成含有不同濃度(0.01、0.1、1和2 g/L)PSC浸提液的ECM[23]。

1.4 MTT檢測HUVECs的增殖

用含有不同濃度(0、0.01、0.1、1和2 g/L)PSC浸提液的ECM培養HUVECs，采用MTT法比較其對HUVECs的增殖作用。細胞按密度3×103個/孔等量接種于96孔板中，每組5個復孔，37 ℃、5%CO2細胞孵育箱中孵育貼壁。24 h后，分別加入100 μL含不同濃度PSC浸提液的ECM，記為第0天，隔天換液。第1、3、5、7、10天，待測培養孔內加入180 μL新鮮ECM、20 μL 5 g/L MTT溶液，培養4 h后，每孔加入150 μL DMSO，置37 ℃搖床上振蕩10 min至結晶物充分溶解。各孔溶液轉移入新的96孔板，置于酶標儀內，以波長490 nm測定光密度值。實驗重復3次，以培養時間為橫坐標，平均光密度值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。

1.5 實時反轉錄聚合酶鏈反應(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, real-time RT-PCR)檢測HUVECs成血管基因VEGF、bFGF的表達

根據第1.4小節細胞增殖實驗結果，選擇最適于細胞生長的PSC浸提液濃度用于觀察PSC對HUVECs分化的作用。采用real-time RT-PCR法檢測血管生長因子VEGF、bFGF的基因表達情況。細胞分別按密度1×105、0.8×105、0.5×105個/孔接種于6孔板中，37 ℃、5%CO2細胞孵育箱中孵育貼壁。24 h后，按實驗分組分別加入1 mL PSC浸提液或ECM，記為第0天，隔天換液。第2、4、7天用Trizol裂解細胞，提取總RNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master反轉錄試劑盒，各組均用2.0 g總RNA在20 μL反應體系中進行反轉錄合成cDNA。目的基因為VEGF、bFGF，將管家基因GAPDH作為內參，引物序列見表1。Real-time RT-PCR為每管20 μL的擴增反應體系，95 ℃ 3 min預變性同時激活DNA聚合物，95 ℃變性3 s，60 ℃退火及延伸20 s，共40個循環。數據分析采用2-ΔΔCt法，實驗重復3次。

表1 Real-time RT-PCR中成血管基因的引物序列Table 1 Primers of target genes for real-time RT-PCR

1.6 體外小管形成實驗檢測HUVECs的血管形成能力

根據第1.4小節細胞增殖實驗結果，選擇最適于細胞生長的PSC浸提液濃度，采用體外小管形成實驗檢測HUVECs形成血管的能力。將Matrigel基質膠4 ℃溶解，96孔板置于冰盒上，每孔加入50 μL基質膠。在37 ℃、5%CO2孵箱中放置30 min后，HUVECs分別重懸于PSC浸提液或ECM中，按每孔3 000個接種于基質膠上，避免產生氣泡。第4、10小時使用活細胞染色試劑盒進行細胞染色，倒置相差顯微鏡下觀察小管形成情況。每孔選取9個視野進行小管計數，應用Image J軟件對小管數量進行統計學分析，實驗重復3次。

1.7 統計學分析

采用SPSS 24.0軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析(ANOVA)分別對各組別細胞的增殖情況、血管生長因子基因表達情況、小管形成實驗的成管數目進行總體分析，組間比較采用LSD檢驗，如果數據方差不齊則采用秩和檢驗(Kruskal-WallisHtest)，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PSC對HUVECs增殖的作用

用MTT法檢測HUVECs在不同濃度PSC浸提液作用下的增殖情況(圖1)， 結果顯示，含有0.1 g/L PSC浸提液組對細胞增殖的促進作用最為顯著，其光密度值在第5、7天時高于ECM組，差異有統計學意義(P<0.001，P<0.001)；含有1 g/L PSC浸提液組對細胞增殖也有一定的促進作用，光密度值在第5、7天高于ECM組，其中第5天的差異具有統計學意義(P<0.001)， 但第7天時光密度值仍低于0.1 g/L組，差異有統計學意義(P=0.033)；含有2 g/L PSC浸提液組對細胞的增殖呈現出一定的抑制作用，其第10天光密度值低于ECM組，差異有統計學意義(P=0.001)； 0.01 g/L組在各時間點與ECM組的差異無統計學意義。

ECM, endothelial cell medium; PSC, phytic acid derived bioactive P2O5-SiO2-CaO gel-glasses; HUVECs, human umbilical vein endothelial cells. *P<0.05, 0.1g/L vs. ECM; #P<0.05, 1 g/L vs. ECM; & P<0.05, 2 g/L vs. ECM.圖1 PSC對HUVECs增殖的作用Figure 1 Effect of PSC on HUVECs proliferation

2.2 PSC對HUVECs成血管基因VEGF、bFGF表達的作用

根據第2.1小節實驗結果，選擇含0.1 g/L PSC浸提液對HUVECs進行培養，采用real-time RT-PCR法檢測HUVECs成血管基因VEGF、bFGF的表達情況，結果顯示第4天時，PSC組VEGF、bFGF的基因表達量分別是ECM組的 1.59倍(P=0.011)和1.45倍(P=0.020)；第7天時，PSC組VEGF、bFGF的基因表達量分別是ECM組的 1.98倍(P=0.021)和1.37倍(P=0.018)， 與ECM組之間的差異具有統計學意義(圖2)。

ECM, endothelial cell medium; PSC, phytic acid derived bioactive P2O5-SiO2-CaO gel-glasses; VEGF, vascular endothelial growth factor; bFGF, basic fibroblast growth factor; HUVECs, human umbilical vein endothelial cells.圖2 PSC對HUVECs成血管基因VEGF、bFGF表達的作用Figure 2 Effect of PSC on the mRNA expression of VEGF and bFGF

2.3 PSC對HUVECs體外形成小管能力的作用

選擇含0.1 g/L PSC浸提液的ECM對HUVECs進行培養，用體外小管形成實驗檢測PSC對HUVECs血管形成能力的作用。結果顯示第4小時PSC組、ECM組均以細胞堆疊及出芽形成分支結構為主，完整的小管數量較少(圖3A、B)。鏡下計數及Image J軟件分析顯示，PSC組的小管數目(12.33±2.18)多于ECM組(10.33±3.82)，但兩組間差異無統計學意義(圖3C)。在第10小時，PSC組、ECM組均形成了大量小管結構，PSC組的小管結構相對完整且分布密集，而ECM組仍見到一些未連成管的分支結構(圖3D、E)， 計數結果顯示PSC組的小管數目(29.63±2.29)顯著高于ECM組(20.13±2.36)， 差異具有統計學意義(P=0.033,圖3F)。

3 討論

血管再生在創傷愈合、組織修復再生中具有重要意義，伴行的血管可以為細胞及新生組織提供氧氣和營養物質，清除代謝產物，同時發揮引導和蓄積細胞、生長因子等作用，為骨代謝提供關鍵信號[24]。在組織工程化骨內，周圍來源的組織營養液彌散范圍僅1 mm，因此血管生成不足將導致新生組織無法獲得持續的養分和氧氣供給，新生組織周圍微環境和生化信號改變，非正常細胞募集，最終導致生物材料與機體的融合替代失敗，無法實現組織的新生和長期維持[5]。

ECM, endothelial cell medium; PSC, phytic acid derived bioactive P2O5-SiO2-CaO gel-glasses; HUVECs, human umbilical vein endothelial cells. A, HUVECs tubule formation of PSC group on the 4th hour; B, HUVECs tubule formation of ECM group on the 4th hour; C, the number of tubules on 4th hour; D, HUVECs tubule formation of PSC group on the 10th hour; E, HUVECs tubule formation of ECM group on the 10th hour; F, the number of tubules on 10th hour.圖3 PSC對HUVECs形成小管的作用Figure 3 Effect of PSC on HUVECs tubule formation

在骨組織工程中應用具有良好成骨、成血管作用的生物材料，在骨組織愈合的同時形成相伴行的血管，有利于解決新生組織營養供給不足的問題，從而更好地實現骨缺損修復。回顧以往研究[11-17]，生物活性玻璃能夠促進血管生長因子基因表達與蛋白合成，刺激血管內皮細胞增殖，進而促進小管結構形成與成熟。Day等[11]在含有45S5生物活性玻璃的培養基里培養成纖維細胞，發現低濃度(0.01%～0.2%)生物活性玻璃能夠促進成纖維細胞增殖，0.01%生物活性玻璃能夠顯著促進成纖維細胞分泌VEGF。Mao等[25]用58S、80S生物活性玻璃溶出物培養HUVECs，發現能夠激活VEGF、bFGF及其受體基因，促進VEGF、bFGF蛋白合成，進而刺激HUVECs增殖，加速細胞遷移，發揮促進血管形成的作用。但也有研究發現，生物活性玻璃未能表現出促進血管形成的作用[18-20]，傳統45S5生物活性玻璃在體液中溶解后釋放大量陽離子，導致溶液pH值明顯升高，隨濃度變化可達8.8～9.0[26]，高堿性環境不利于血管內皮細胞增殖，影響其形成血管的作用[27]。此外，Leu等[28]用含有45S5生物活性玻璃(0.6、1.2、6和12 mg)涂層的膠原海綿材料培養內皮細胞，發現1.2 mg組能夠顯著促進細胞增殖、VEGF基因表達及血管形成，0.6和6 mg組對細胞增殖和基因表達的促進作用弱于1.2 mg組，而12 mg組則對細胞增殖、基因表達產生抑制作用，提示生物活性玻璃對細胞的生物刺激作用具有濃度依賴性，選擇適宜濃度的生物活性玻璃也是實現血管再生的關鍵因素之一。

本研究中，0.1、1 g/L PSC浸提液對HUVECs增殖具有促進作用，其中以0.1 g/L增殖促進作用最為顯著，較低濃度0.01 g/L對HUVECs的增殖無明顯促進作用，而較高濃度2 g/L的濃度對HUVECs的增殖具有抑制作用。生物活性玻璃對細胞的增殖、分化等行為的調控具有濃度依賴性，且Si、Ca離子的濃度對細胞的增殖、分化等產生重要影響。Shie等[31]研究發現，適宜濃度(4 mmol/L)的Si離子通過刺激細胞進入細胞周期S、G2期促進細胞增殖，而較高濃度(6 mmol/L)的Si離子會導致細胞增殖顯著下降。Maeno等[32]則發現2～8 mmol/L Ca離子有利于成骨細胞增殖、分化及礦化，濃度高于10 mmol/L的Ca離子則具有成骨細胞毒性。由此可見，生物活性玻璃釋放的離子濃度與其生物刺激作用呈現一種“雙向”關系，其離子濃度在適宜范圍內發揮正向生物刺激作用，而當離子濃度過低或過高時，細胞的活性將受到抑制。本研究中，0.1 g/L PSC浸提液最適于HUVECs增殖，可能與其釋放適宜濃度的Si、Ca等離子有關；而2 g/L PSC浸提液可能釋放過高濃度的Si、Ca離子，對細胞的生理活動產生抑制作用，因此，篩選適宜的生物活性玻璃濃度有利于細胞更好的生長，對觀察其生物學作用具有重要意義。

本研究顯示，0.1 g/L PSC浸提液在第4、7天能夠顯著上調HUVECs內VEGF、bFGF的基因水平；在小管形成實驗第10小時，即血管形成中期，PSC組小管的成熟度及密度顯著優于ECM組。上述結果提示PSC具有良好的促血管形成作用，這與以往許多生物活性玻璃成血管的研究結果一致[11-17]。同時，研究表明生物活性玻璃釋放Si離子在其促血管化過程中發揮關鍵作用[33-34]。生物材料釋放高濃度的Si離子能夠顯著上調VEGF、bFGF等促血管生成因子及其受體表達，刺激血管內皮細胞合成血管源性一氧化氮合酶，增加一氧化氮表達，而一氧化氮作為調節因子及VEGFR-2反應的下游介質，進一步調節血管細胞遷移與血管形成[33-34]。此外，Si主要分布于骨組織中的鈣化活躍區，通過在組織修復早期誘導血管化及骨基質礦化，加速骨組織再生[35]。本課題組在前期研究中，將PSC、45S5生物活性玻璃溶于DMEM浸提24 h配制成0.1 g/L浸提液，采用離子體發射光譜法檢測Si、Ca、P離子釋放情況，發現PSC、45S5生物活性玻璃能夠顯著升高溶液中Si濃度[DMEM中Si (0.70±0.23)×10-3g/L]，且PSC釋放的Si、P離子濃度[Si (19.43±0.33)×10-3g/L，P (31.59±3.76)×10-3g/L]顯著高于45S5生物活性玻璃[Si (13.96±0.65)×10-3g/L，P (27.78±2.66)×10-3g/L][26]，因此，PSC對HUVECs增殖及血管形成有良好的促進作用，與其釋放較高的Si離子密切相關。除此之外，PSC磷含量的增加使其在溶解過程中具有更窄的pH值變化范圍，由此可以避免形成高堿環境影響細胞的活性，更有利于促進血管再生。

綜上所述，PSC能夠促進HUVECs增殖、VEGF和bFGF基因表達以及血管形成。PSC的上述作用具有濃度依賴性，因此為發揮最大的生物學效應，在制備成臨床應用材料時選取適宜的材料配比至關重要。