炎癥生物標志物對輸尿管尿路上皮癌患者預后預測的臨床價值

陳懷安，劉 碩，李秀君，王 哲，張 潮，李鳳岐，苗文隆

(河北北方學院附屬第一醫院泌尿外科，河北張家口 075061)

腫瘤微環境，即腫瘤細胞產生和生活的內環境，不僅包括腫瘤細胞本身，還包括其周圍的成纖維細胞、免疫炎癥細胞、膠質細胞等各種細胞以及附近區域內的細胞間質、微血管等[1]。腫瘤的發生是由腫瘤細胞及微環境相互作用所構成的腫瘤-宿主界面失衡所致。炎癥相關生物標志物(inflammatory biomarkers，InfBMs)是腫瘤微環境的重要組成部分，在腫瘤的發生、侵襲、轉移等多方面影響腫瘤進程，已證實與乳腺癌、宮頸癌、肺癌和胃癌等多個腫瘤的預后有關[2]，也與輸尿管癌的惡性程度及術后進展有關，但目前尚缺乏大樣本隨訪資料驗證其與預后的關系。本研究擬探討輸尿管尿路上皮癌腫瘤組織中腫瘤浸潤性中性粒細胞(tumor-infiltrating neutrophil，TIN)、腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)、淋巴細胞等與患者預后的關系，將InfBMs引入輸尿管尿路上皮癌的預后評估體系作為現有病理分級和分期系統的完善和補充，以更準確地預測術后復發及進展風險，為精準個體化治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 患者一般資料

回顧性分析河北北方學院附屬第一醫院泌尿外科2005—2018年間收治的輸尿管尿路上皮癌患者臨床資料279例，根據如下納入和排除標準確定入組個體。納入標準：有完整的臨床、病理及隨訪資料；術前臨床檢查排除轉移；符合世界衛生組織制定的輸尿管尿路上皮癌的診斷標準；手術后病理檢查證實為輸尿管尿路上皮癌。排除標準：復發的輸尿管尿路上皮癌患者；術前合并感染性疾病；入院檢查證實合并其他部位腫瘤；有手術并發癥。最終有200例患者納入本研究，其中106例為經后腹腹腔鏡手術，94例為傳統開放手術。

1.2 方法

采用分割樣本驗證(split-sample validation)將所有入組病例隨機分為建模組(n=160)和驗證組(n=40)， 前者用于相關預后列線圖模型的建立，后者用于驗證該模型的準確度。記錄患者年齡、性別、腫瘤大小、病理分期、病理分級、手術方式等情況，回顧并記錄患者血常規檢查中白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞、血清白蛋白、血小板、血紅蛋白等參數數值。對入組患者石蠟病理標本進行回顧，免疫組織化學法檢測腫瘤組織中TIN(CD66b+標記)、TAM(CD163+標記)表達情況，顯微鏡高倍視野下(×400)觀察各項細胞的免疫染色情況，每張組織切片取5個視野，用Image-pro Plus軟件計算CD66b+TIN細胞(呈棕黃色)、CD163+TAM細胞(呈熒光綠色)百分比。計算外周血中性粒細胞/淋巴細胞比值(neutrophil/lymphocyte ratio，NLR)、腫瘤組織中性粒細胞/單核細胞比值(neutrophil/monocyte ratio，NMR)。按病理分期結果將入組患者分成非肌層浸潤性和肌層浸潤性輸尿管尿路上皮癌組，分別建立預后預測列線圖模型。對模型進行分辨度評價，分別建立僅包含外周血參數和包含全部參數(年齡、性別、腫瘤大小、病理分期、病理分級、手術方式、TIN、TAM、NLR、NMR)的預后列線圖模型，比較兩種模型對輸尿管尿路上皮癌患者預后判斷的準確性。

1.3 評估標準

無進展生存時間：起點為手術時間，止點為臨床證實腫瘤出現局部復發、淋巴結轉移或遠處器官轉移。腫瘤相關生存率：起點為手術時間，止點為腫瘤直接導致的死亡時間。腫瘤進展一般包括淋巴結轉移、局部腫瘤復發、遠處器官轉移，不包括術后膀胱內復發腫瘤。

1.4 統計學方法

應用SPSS 21.0進行統計分析。采用配對t檢驗對同一個體外周血與腫瘤組織中的炎癥細胞進行比較，Kaplan-Meier法進行單因素生存分析，并行Log-Rank檢驗，經單因素分析篩選所得變量采用Cox比例風險模型進行多因素分析。應用R Project for Statistical Computing 2.14.1統計軟件制作預測列線圖，統計學方法為Cox回歸分析。通過單變量Cox比例風險回歸分析評估各個預測因子對輸尿管尿路上皮癌術后出現腫瘤復發風險的影響，多變量Cox比例風險回歸分析后退法對預測因子進行篩選，得到有統計學意義的預測因子。應用篩選出來的預測因子分別建立預測輸尿管尿路上皮癌出現3年無進展生存率Cox比例風險回歸模型，建立相應列線圖模型。采用Bootstrap自抽樣法對所得列線圖進行內部驗證，并進行分辨度評價，以一致性指數(index of concordance，C-index)表示。

2 結果

2.1 隨訪結果

200例患者的中位隨訪時間60個月，無進展生存時間40個月，術后3年進展42例(21.0%)。

2.2 建模組與驗證組的一般資料、病理學特征和炎癥相關生物標志物

驗證組與建模組的年齡、性別、腫瘤大小、病理分級、病理分期、手術方式、TIN、TAM、NLR、NMR，差異均無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 建模組(n=160)與驗證組(n=40)的一般資料、病理學特征、炎癥相關生物標志物分析Table 1 General information, pathological characteristics, inflammatory immune related factors analysis of the model group (n=160) and the verification group (n=40)

2.3 預測輸尿管尿路上皮癌首次復發的單因素和多因素變量

腫瘤大小、病理分級、病理分期等指標均為預測輸尿管尿路上皮癌術后3年首次復發的單因素變量，腫瘤大小、病理分級、病理分期、TIN、TAM、NLR、NMR是預測輸尿管尿路上皮癌術后3年首次復發的多因素變量(表2、表3)。

表2 預測輸尿管尿路上皮癌術后首次復發的單因素變量分析Table 2 Univariate analysis of predicting the first recurrence of ureteral and urothelial carcinoma after operation

表3 預測輸尿管尿路上皮癌復發的多因素Cox回歸分析結果Table 3 Multivariate cox regression analysis for predicting recurrence of ureteral epithelial carcinoma

2.4 非肌層浸潤性和肌層浸潤性輸尿管尿路上皮癌術后無進展生存率的全參數模型校正圖分析

非肌層浸潤性輸尿管尿路上皮癌104例，術后3年首次復發10例(9.6%)，肌層浸潤性輸尿管尿路上皮癌96例，術后3年首次復發32例(33.3%)，兩組間差異有統計學意義(χ2=15.53，P<0.05)。建立兩組無進展生存率的全參數模型校正圖發現，非肌層浸潤組和肌層浸潤組無進展生存率預測校正圖一致性指數分別為0.722(95%CI：0.70～0.78)和0.725(95%CI：0.71～0.79)，與實際觀察到的3年生存率一致性較佳(圖1)。

圖1 預測肌層浸潤性(A)和非肌層浸潤性(B)輸尿管尿路上皮癌術后無進展生存率的全參數模型校正圖Figure 1 Full-parameter model correction chart for predicting progression-free survival after myometrial invasive (A) and non-muscular invasive (B) surgery for ureteral epithelial carcinoma

2.5 全參數與外周血參數預后預測列線圖模型分析

區分度測試結果顯示，輸尿管尿路上皮癌的全參數預后預測模型一致性指數為0.726(95%CI：0.69～0.77)，高于輸尿管尿路上皮癌的外周血參數預后預測模型(一致性指數為0.672，95%CI：0.66～0.74)， 尿路上皮癌腫瘤組織的免疫微環境提高了模型的預測準確性(圖2)。

圖2 全參數(A)與外周血參數(B)預測術后無進展生存率列線圖模型校正圖Figure 2 Calibration chart of nomogram model for predicting progression free survival rate with full parameters (A) and peripheral blood parameters (B)

3 討論

2011年美國癌癥研究學會(American Association for Cancer Research，AACR)對腫瘤微環境做出新定義，并明確提出腫瘤微環境能促進惡性腫瘤的形成、生長和侵襲，保護腫瘤細胞免受機體免疫系統的損傷[3-4]。TAM可誘導腫瘤細胞周圍淋巴管的生成，與腫瘤的血管侵襲、淋巴結及遠處器官轉移相關，提示預后不良[5-6]。在大量的惡性上皮腫瘤中，NLR增高通常會引發全身性炎癥反應，通過抑制腫瘤細胞凋亡、促進血管新生和誘發DNA 損傷，促進腫瘤細胞的增殖和轉移，近期的許多研究發現，患者術前外周血參數，尤其是炎癥相關細胞參數，如白細胞計數及白細胞分類(單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等)計數、NLR、血小板/淋巴細胞比值與許多腫瘤的預后具有相關性[7-8]，也有研究發現術前患者外周血白細胞計數和紅細胞分布寬度可作為發生在上尿路的尿路上皮癌患者預后的參考因素[9-10]。

腫瘤微環境對腫瘤的治療效果、腫瘤進展、生物學行為等均有影響。腫瘤間質大部分由TAM構成，巨噬細胞起源于血液系統，腫瘤相關趨化因子可集聚巨噬細胞至腫瘤組織，經一系列分化后轉化為TAM，TAM的功能包括形成新生血管，同時與輸尿管尿路上皮癌的進展及生長、激素易感性、腫瘤的轉移及浸潤等因素密切相關[11-12]。研究發現，巨噬細胞能夠促進腫瘤的啟動和惡性腫瘤演進，在腫瘤的啟動階段，巨噬細胞可創造出一個促變異的炎性環境，促進腫瘤生長，當腫瘤轉變為惡性，巨噬細胞又能夠促進腫瘤血管生成，增強腫瘤細胞的侵犯及遷移，抑制抗腫瘤免疫[13-14]。同時，巨噬細胞為腫瘤細胞到達提供靶向組織。絕大多數TAM可被激活為M2型巨噬細胞，產生白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-10等大量抗炎因子，抑制腫瘤免疫，促進腫瘤免疫逃逸。腫瘤的進展不僅取決于腫瘤細胞本身，而且與腫瘤細胞所處的內環境密切相關[15-16]。腫瘤細胞與腫瘤微環境相互作用形成內穩態，為腫瘤提供生存微環境，同時可控制腫瘤細胞的進展。輸尿管尿路上皮癌的發生和發展并非由上皮細胞或腫瘤微環境單方面決定，而是由二者相互作用形成，腫瘤微環境中腫瘤相關的免疫功能由多種免疫細胞相互作用，如巨噬細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞等[17]。腫瘤微環境中，TIN經腫瘤刺激后會分化為不同表型，對腫瘤的進展起到抑制或促進作用，TIN產生的趨化因子及細胞因子可影響腫瘤微環境內的炎癥細胞的激活及集聚，還能釋放堿性磷酸酶，當釋放過量時，會導致組織損傷，破壞癌周組織，為腫瘤的擴散提供有利條件[18]；TIN產生的趨化因子及細胞因子可降解機體的受體、補體、免疫球蛋白，阻斷腫瘤壞死因子介導的細胞凋亡途徑，促進腫瘤細胞的增殖[13]；TIN可分泌彈性蛋白酶，分解腫瘤細胞內胰島素底物受體，增強血小板源性生長因子受體及磷脂酰肌醇3-激酶，直接誘導輸尿管尿路上皮癌的增殖，同時TIN可促進腫瘤血管生成，通過直接接觸或可溶性分子與TAM相互作用，在炎癥應答的消退期，TAM會吞噬凋亡的TIN，減少自身IL-23的生成，增加T細胞分泌IL-17水平，促進TIN的生成[19]。

本研究對炎癥相關生物標志物與輸尿管尿路上皮癌預后之間的關系進行了分析，發現腫瘤大小、病理分級、病理分期、TIN、TAM、NLR、NMR是影響腫瘤復發的多因素預測因子[10]。本研究探討了外周血與腫瘤組織中相應炎癥細胞計數的相關性，通過多因素分析，分別建立以外周血標本相關參數為基礎的非肌層浸潤性或肌層浸潤性輸尿管尿路上皮癌列線圖預后判斷模型，并得到驗證，非肌層浸潤組和肌層浸潤組無進展生存率預測列線圖一致性指數分別為0.722(95%CI：0.70～0.78)和0.725(95%CI：0.71～0.79)，與實際觀察到的3年生存率一致性較佳，從模型中可以看出非肌層浸潤性或肌層浸潤性輸尿管尿路上皮癌列線圖預測預后具有一定的意義。各個預測因子的分值總和可在總分軸上獲得定位，該定位在概率軸上的對應點即為輸尿管尿路上皮癌術后復發的概率，將這一概率代入至校正圖中進行校正后，可以獲得個體非肌層浸潤性輸尿管尿路上皮癌患者經治療后腫瘤復發的預測概率。根據概率，臨床醫師可以評估患者出現腫瘤術后復發的危險程度，并根據此制定個性化治療及隨訪方案，防止出現過度治療及治療不足。本研究結果提示，輸尿管尿路上皮癌的全參數預后預測模型一致性指數為0.726(95%CI：0.69～0.77)，高于輸尿管尿路上皮癌的外周血參數預后預測模型(一致性指數為0.672，95%CI：0.66～0.74)， 因此，建立以炎癥相關生物標志物為基礎的全參數預后預測模型，可以作為現有病理分級和分期系統的完善和補充。尿路上皮癌腫瘤組織的免疫微環境提高了模型的預測準確性，為輸尿管尿路上皮癌患者的精準個體化治療提供了依據；此外，本研究還建立了以外周血標本相關參數為基礎的輸尿管尿路上皮癌列線圖預后判斷模型，并得到驗證，根據模型，泌尿外科醫生可以在術前尚未獲得病理標本前，對輸尿管尿路上皮癌的預后風險進行預判，為臨床醫生選擇恰當的手術方式提供依據。

邢云超等[20]的上尿路尿路上皮癌術前預后相關因素分析及初步風險分層構建模型中包括淋巴結轉移、腫瘤直徑、表皮生長因子、病理分期、血肌酐含量等預測因子，本研究的模型新增了TIN、TAM、NLR、NMR 4個獨立預測因子，可用于評估輸尿管尿路上皮癌患者預后和腫瘤進展情況。同時，與之前的輸尿管尿路上皮癌列線圖預測模型相比，本研究為單中心研究，其優勢是避免了各研究中心在隨訪方案、病理學分期、腫瘤分期的差異對模型預測準確性的影響，但同時也限制了模型中患者隊列的病例數及模型的應用普遍性。此外，本研究設計的模型還具有如下的局限性：應用Bootstrap內部驗證法驗證模仿患者隊列模型的準確性，提示當模型應用于其他相似的患者隊列時會獲得相似的準確性，但需新的患者隊列外部驗證模型，以得到更真實的預測性能；此外，模型的預測準確性并不完美，因模型未考慮到所有已知的預測因子，無法最佳整合已知的預測因子。

綜上所述，本研究建立了以炎癥相關生物標志物為基礎的全參數預后預測模型，可以作為現有病理分級和分期系統的完善和補充，為輸尿管尿路上皮癌患者的精準個體化治療提供了依據。本研究還建立了以外周血標本相關指標為基礎的預后預測模型，該模型具有標本易于獲取且檢測方法簡單、經濟的優勢，利于臨床推廣應用。