血漿Dickkopf-1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)及其與外周血T細(xì)胞亞群的相關(guān)性

曹 迪，王 燕△，王柳青，孫曉麟，黃 妃，孟 洋，任麗麗，張學(xué)武△

(1. 鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 鄭州 450000； 2. 北京大學(xué)人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 北京 100044； 3. 遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕科， 貴州遵義 563000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其特征是持續(xù)性滑膜炎，導(dǎo)致軟骨和骨質(zhì)的破壞，并導(dǎo)致多個(gè)關(guān)節(jié)的畸形、功能障礙和生活質(zhì)量下降[1]。最近，越來(lái)越多的證據(jù)表明RA的發(fā)病機(jī)制受到多種因素的影響，其中Dickkopf-1(DKK-1)的異常表達(dá)引起的骨代謝功能障礙參與了RA中病理性骨侵蝕的發(fā)病機(jī)制。一直以來(lái)，T 細(xì)胞過(guò)度活化被認(rèn)為是 RA 發(fā)病的根本原因，RA 患者體內(nèi)常存在著異?；罨?T 細(xì)胞和/或 T 細(xì)胞亞群數(shù)量的改變。目前研究認(rèn)為主要是Th1/Th2、Th17/Treg兩組細(xì)胞間的失衡，導(dǎo)致Th1、Th17產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-17、TNF-α等水平升高，而Th2、Treg細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎細(xì)胞因子水平降低，從而導(dǎo)致自身免疫功能紊亂，誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[2]。

Chae等[3]發(fā)現(xiàn)DKK-1在Foxp3+Treg細(xì)胞中表達(dá)，以膜結(jié)合形式抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性結(jié)腸炎。Chae等[4]關(guān)于 DKK-1與哮喘發(fā)病的研究結(jié)果提示 DKK-1在Th2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，將 DKK-1與T細(xì)胞的研究進(jìn)一步深入,以上研究結(jié)果提示DKK-1可能影響T細(xì)胞的分化和功能。然而，DKK-1是否調(diào)控RA患者T淋巴細(xì)胞參與的自身免疫性炎癥還不清楚,因此本研究旨在分析RA患者中血漿DKK-1水平變化與外周血T細(xì)胞亞群、臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究隨機(jī)選取2018年9月至2019年5月就診于北京大學(xué)人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門(mén)診及住院的RA患者(實(shí)驗(yàn)組)32例，其中男6例、女26例；平均年齡(63.09±11.07)歲，病程平均(12.06±10.43)年，均符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology, ACR)修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)[5]，且近半年未使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑治療。排除精神性疾病,腫瘤,合并嚴(yán)重臟器受損,重癥類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,處于妊娠、分娩或哺乳期的女性患者。另選取年齡和性別相匹配的體檢中心的健康對(duì)照(對(duì)照組)20例，均無(wú)感染、免疫等可能與RA相關(guān)的疾病，其中男7例，女13例，平均年齡(59±8.03)歲，上述所有患者均留取血漿。本實(shí)驗(yàn)獲得北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)： 2017PHB165-01)， 研究對(duì)象包括患者和健康人均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1樣本的采集和處理 清晨空腹采集RA患者和健康對(duì)照組靜脈全血5 mL置于肝素鈉采血管中；采用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll法)分離外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)后，吸取上層血漿分裝于無(wú)菌管中，置于-80 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆?；中間的PBMCs層用于流式檢測(cè)T細(xì)胞亞群。

1.2.2外周T細(xì)胞亞群的檢測(cè) 將搜集的PBMCs用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管中，加入200 μL的PBS重懸，向細(xì)胞懸液中加入熒光標(biāo)記的抗體CD3-AF700、CD4-FITC、CD8-PerCp、CD25-PE、CD127-BV605、CD161-PE-CF594、CD45RA-BV510(購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司)、CXCR5-AF647(購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司)進(jìn)行染色，4 ℃避光孵育30 min后，加入2 mL PBS，1 800 r/min離心6 min洗滌細(xì)胞，最后加入200 μL的PBS重懸，過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。采用 BD FACS Arial Ⅱ流式細(xì)胞術(shù)儀檢測(cè)各細(xì)胞亞群的表達(dá)水平，并使用FlowJo軟件(V7.6.1)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。外周血T細(xì)胞亞群的定義如下:Treg：CD4+CD25hiCD127lo；天然型nTreg：CD4+CD45RA+CD25lo；激活型aTreg：CD4+CD45RA-CD25hi；分泌型sTreg：CD4+CD45RA-CD25lo；Teff：CD4+CD25-；Tfh：CD4+CXCR5+。

1.2.3血漿DKK-1水平的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)血漿DKK-1水平，DKK-1商品化試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科公司，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 收集臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)：年齡，性別，病程，紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)，C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)，疾病活動(dòng)度評(píng)分(disease activity score 28，DAS28)，類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor, RF)，抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-citrullinated protein antibody, anti-CCP)，免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，免疫球蛋白A (immunoglobulin A, IgA)，免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)，補(bǔ)體C3(complement C3)，補(bǔ)體C4(complement C4)，白細(xì)胞(white blood cell，WBC)計(jì)數(shù)，中性粒細(xì)胞百分比(neutrophil ratio, Neu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，作圖采用Graphpad prism 8.0.2軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)(最小值，最大值)表示。兩組間計(jì)量資料按數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；多組間計(jì)量資料服從正態(tài)分布的采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行多組比較，如果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步用Bonferroni進(jìn)行兩兩比較。非正態(tài)分布用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)進(jìn)行多組之間兩兩比較，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用受試者工作特征曲線(recei-ver operating characteristic curve，ROC)確定DKK-1水平的臨界值。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象資料

研究對(duì)象的臨床基本資料見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象的臨床基本資料Table 1 Basic clinical data of study subjects

2.2 RA組與健康對(duì)照組血漿DKK-1水平、外周血CD8+CD161+T細(xì)胞百分比比較

RA組血漿DKK-1水平顯著高于健康對(duì)照組[(124.97±64.98) ng/Lvs. (84.95±13.74) ng/L，P<0.05]，見(jiàn)圖1A。RA組外周血CD8+CD161+T細(xì)胞百分比顯著高于健康對(duì)照組(19.27%±11.58%vs. 11.64%±5.44%，P<0.05)，見(jiàn)圖1B。

A, Plasma DKK-1 levels in RA and healthy controls; B, Percentage of CD8+CD161+T cells in peripheral blood of RA group and healthy control group.RA, rheumatoid arthritis; HC, healthy controls；DKK-1，Dickkopf-1.圖1 RA組和健康對(duì)照組血漿DKK-1的水平及外周血CD8+CD161+T細(xì)胞的百分比Figure 1 Levels of plasma DKK-1 and percentage of peripheral blood CD8+CD161+T cells in RA group and healthy control group

2.3 RA組血漿DKK-1水平與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性

血漿DKK-1水平與ESR(r=0.406，P=0.021)、DAS28評(píng)分(r=0.372，P=0.036)、IgG(r=0.362，P=0.042)、IgA(r=0.377，P=0.033)呈正相關(guān)；與年齡、病程、CRP、RF、抗CCP抗體、IgM、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、WBC、Neu無(wú)相關(guān)性。

2.4 血漿DKK-1水平與外周血T細(xì)胞亞群之間的相關(guān)性分析

通過(guò)ROC分析，由ROC曲線下面積為0.667(95%CI： 0.519，0.815)確定血漿DKK-1濃度的臨界值為101.00 ng/L,根據(jù)這個(gè)臨界值把RA患者血漿DKK-1水平分為DKK-1升高組和DKK-1正常組,與健康對(duì)照組比較所對(duì)應(yīng)的各T細(xì)胞亞群的百分比見(jiàn)圖2。

A,Treg percentage；B，nTreg percentage；C，aTreg percentage； D，sTreg percentage；E，Teff percentage；F，Tfh percentage； G，CD4+CD161+T cell percentage；H，CD8+T cell percentage；I，CD8+CD161+T cell percentage；HC, healthy controls; DKK-1, Dickkopf-1.圖2 DKK-1升高組、DKK-1正常組、健康對(duì)照組外周血T細(xì)胞亞群百分比之間的差異Figure 2 Differences in peripheral blood T Cell subsets in DKK-1 elevated group, DKK-1 normal group, and healthy control group

血漿DKK-1升高組的RA患者外周血CD8+CD161+T細(xì)胞百分比較健康對(duì)照組和DKK-1正常組患者顯著升高(P=0.001), 進(jìn)一步的相關(guān)性分析兩者呈正相關(guān)(r=0.413，P=0.019)；血漿DKK-1升高組患者外周血nTreg細(xì)胞百分比(P=0.027)和DKK-1正常組患者外周血nTreg細(xì)胞百分比(P=0.019)顯著高于健康對(duì)照組；血漿DKK-1正常組患者外周血Teff細(xì)胞百分比顯著高于健康對(duì)照組(P=0.045)；血漿DKK-1升高組患者外周血Tfh細(xì)胞百分比(P=0.001)和DKK-1正常組患者外周血Tfh細(xì)胞百分比(P=0.009)顯著高于健康對(duì)照組；血漿DKK-1正常組外周血CD8+T細(xì)胞百分比顯著高于健康對(duì)照組(P=0.001),與Treg、aTreg、sTreg、CD4+CD161+T細(xì)胞無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)圖2、3。

DKK-1，Dickkopf-1.圖3 RA患者血漿DKK-1水平與外周血CD8+CD161+T細(xì)胞之間的相關(guān)性Figure 3 Correlation between plasma DKK-1 levels and peripheral blood CD8+ CD161+T cells in RA patients

2.5 外周血CD8+CD161+T細(xì)胞百分比與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析，

外周血CD161+CD8+T細(xì)胞與ESR(r=-0.415，P=0.004)、CRP(r=-0.393，P=0.007)、DAS28評(píng)分(r=-0.392，P=0.007)、RF(r=-0.535，P<0.001)、抗CCP抗體(r=-0.589，P<0.001)、IgG(r=-0.368，P=0.012)、IgM(r=-0.311，P=0.035)呈負(fù)相關(guān)，與年齡、病程、IgA、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、WBC、Neu無(wú)相關(guān)性。

3 討論

DKK-1于1998年由Glinka等[6]報(bào)道，是經(jīng)典Wnt途徑的內(nèi)源可溶性抑制劑，Wnt信號(hào)通路在骨穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。DKK-1一方面主要是通過(guò)抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑阻斷成骨細(xì)胞的形成和分化并誘導(dǎo)未成熟成骨細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致骨形成不足；另一方面可能是通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路間接的增強(qiáng)核因子kappa B受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成，從而抑制骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)的分泌，改變OPG ∶RANKL比率，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化增值以促進(jìn)骨吸收[7]，從而參與RA中骨破壞的發(fā)生機(jī)制。DKK-1作為關(guān)節(jié)重塑的主要調(diào)控因子在關(guān)節(jié)炎模型中得到很好的研究，但對(duì)于RA患者循環(huán)中DKK-1的功能知之甚少，而通過(guò)本次研究，我們的結(jié)果展示RA患者血漿DKK-1濃度顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05)， DKK-1水平與ESR、DAS28評(píng)分、IgG、IgA呈正相關(guān)，與年齡、病程、CRP、RF、抗CCP抗體、IgM、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、WBC、Neu無(wú)相關(guān)性，這與之前報(bào)道的結(jié)果一致[8]，Gómez等[9]的研究結(jié)果顯示，在患有嚴(yán)重疾病活動(dòng)或骨侵蝕的患者通常具有更高的DKK-1表達(dá)，表明血漿DKK-1參與RA患者骨侵蝕的發(fā)病機(jī)制并與臨床疾病活動(dòng)程度之間存在顯著相關(guān)性。結(jié)合Gómez等[9]的研究和本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著疾病進(jìn)展和骨質(zhì)破壞的增加，DKK-1的血漿水平將增加，因此血清DKK-1可用作骨破壞的標(biāo)志物。此外我們還檢測(cè)了DKK-1升高組與DKK-1正常組臨床指標(biāo)之間的差異，但因兩組之間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故未將結(jié)果列出。

為了明確DKK-1對(duì)于外周血T細(xì)胞數(shù)量及功能的影響，本研究檢測(cè)了多種T細(xì)胞亞群，并分析了DKK-1與外周血T細(xì)胞亞群之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA組血漿DKK-1水平與外周血CD8+CD161+T細(xì)胞百分比呈正相關(guān)，與Treg、nTreg、aTreg、sTreg、Teff、Tfh、CD4+CD161+T、CD8+T細(xì)胞無(wú)相關(guān)性。

Treg細(xì)胞是抑制自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的T細(xì)胞亞群，Th17和Treg細(xì)胞之間的失衡已被確定為RA發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素。本研究未發(fā)現(xiàn)DKK-1與Treg細(xì)胞之間的相關(guān)性，而Chae等[3]證明Foxp3+Treg細(xì)胞以膜結(jié)合形式表達(dá)DKK-1，以抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的結(jié)腸炎。DKK-1在Foxp3+Treg細(xì)胞中的意外定位和功能表明，DKK-1功能是通過(guò)以細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴方式和旁分泌方式控制T細(xì)胞增殖而成為外周耐受的重要調(diào)節(jié)劑。DKK-1在Foxp3+Treg細(xì)胞中控制外周耐受的新型免疫調(diào)節(jié)作用，突顯了DKK-1是控制自身免疫性疾病的引人注目的分子靶標(biāo)，而在RA患者中DKK-1是否與Treg細(xì)胞存在聯(lián)系有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。

CD161是C型凝集素樣受體，屬于殺傷細(xì)胞凝集素樣受體亞家族(killer cell lectin-like receptor subfamily B member1，KLRB1)， 也稱為NKR-P1[10]，其在CD4+、CD8+T、NK細(xì)胞上廣泛表達(dá)，而關(guān)于CD161在CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)在丙型肝炎、腸炎、結(jié)核等疾病中都有研究，但在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究中很少見(jiàn)。Mitsuo等[11]在關(guān)于CD161+CD8+T細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)SLE、MCTD、SSc和PM/DM患者與健康供體相比，CD161+CD8+T細(xì)胞的百分比和絕對(duì)數(shù)目均減少，而在RA患者中CD161+CD8+T細(xì)胞的百分比沒(méi)有降低，提示RA的發(fā)病機(jī)制可能與其他風(fēng)濕病不同，可能反映了一個(gè)事實(shí)，即所涉及的CD8+T細(xì)胞的特征因疾病類型而異，而本次研究的結(jié)果卻與之不同，從研究結(jié)果來(lái)看RA組CD161+CD8+T細(xì)胞百分比明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)， 也就是說(shuō)CD161+CD8+T細(xì)胞可能在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮部分作用，而CD161+CD8+T細(xì)胞與ESR、CRP、DAS28評(píng)分、RF、抗CCP抗體、IgG、IgM呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明隨著CD161+CD8+T細(xì)胞百分比的增多，RA疾病活動(dòng)相關(guān)的臨床指標(biāo)降低，表明CD161+CD8+T細(xì)胞可能在RA中發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，并一定程度上抑制自身免疫性疾病的發(fā)生。之前有研究表明CD161+CD8+T細(xì)胞與CD8+NKT細(xì)胞密切相關(guān)[11]，而CD8+NKT細(xì)胞可通過(guò)識(shí)別和殺死抗原特異性樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)抑制CD4和CD8 T細(xì)胞反應(yīng)，因此，CD161+CD8+T細(xì)胞可能像CD8+NKT細(xì)胞一樣，對(duì)免疫反應(yīng)產(chǎn)生免疫抑制作用。

Diarra等[8]在人類類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型中確定腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)作為DKK-1的關(guān)鍵誘導(dǎo)劑。CD161+CD8+T細(xì)胞具有效應(yīng)細(xì)胞的功能，特別是具有分泌促炎性細(xì)胞因子(如IL-17、IL-22、TNF-α、IFN-γ或GM-CSF)的能力[12]，而在上述相關(guān)性分析中已經(jīng)明確RA患者中CD161+CD8+T細(xì)胞的百分比與DKK-1的水平呈正相關(guān)，可能是CD161+CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α，誘導(dǎo)DKK-1的表達(dá)上調(diào)，從而參與RA的骨質(zhì)破壞，但在二者中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，一方面RA患者外周血T細(xì)胞亞群中的CD161+CD8+T細(xì)胞明顯升高，同時(shí)血漿DKK-1水平也有所升高，這可能與RA的發(fā)病機(jī)制及促炎細(xì)胞因子的分泌有關(guān)；另一方面CD161+CD8+T細(xì)胞在某種程度上可能會(huì)抑制自身免疫的發(fā)生。因此CD161+CD8+T細(xì)胞既可以是致病性的也可以是保護(hù)性的。DKK-1在參與RA的骨質(zhì)破壞及評(píng)估RA患者的疾病活動(dòng)情況中發(fā)揮著重要的作用，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步探究RA的發(fā)病機(jī)制，為臨床防治提供理論依據(jù)。

本研究仍存在許多不足之處，首先對(duì)于RA患者外周血CD161+CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子水平的未予測(cè)定，在接下來(lái)的研究中可以檢測(cè)細(xì)胞因子的水平變化，來(lái)進(jìn)一步分析DKK-1對(duì)RA患者外周血CD161+CD8+T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的影響；其次本研究納入RA患者及健康對(duì)照者例數(shù)較少，未與其他自身免疫病患者作對(duì)照，可能會(huì)影響研究結(jié)果，之后需要對(duì)更多的人群進(jìn)行更深入的研究；最后未納入RA患者的影像學(xué)資料，在后續(xù)研究中將增加影像學(xué)數(shù)據(jù)，來(lái)更加充分地說(shuō)明DKK-1與骨破壞的關(guān)系。