p53基因點突變的發生與非小細胞肺癌患者病理生理特征的相關性分析

胡其艷

（吉林大學基礎醫學院，吉林 長春 130021）

肺癌的發病率及死亡率均居于其他腫瘤的首位。據統計，全球每年死于癌癥的患者中，肺癌患者的占比約為20 ～25%。非小細胞肺癌是肺癌的分型之一。有研究資料顯示，約有48% 的非小細胞肺癌患者存在p53 基因點突變的情況[1]。另有研究資料顯示，p53 基因點突變的發生是導致肺癌的主要原因[2]。在本次研究中，筆者主要分析p53基因點突變的發生與非小細胞肺癌患者病理生理特征的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究對象是2018 年4 月至2019 年4 月期間吉林大學附屬第一醫院收治的53 例非小細胞肺癌患者。在這53例患者中，有男35 例，女18 例；其平均年齡為（58.2±3.3）歲；其平均腫瘤直徑為（4.6±2.8）cm；其中有33 例腺癌患者，20 例鱗癌患者；其中病理分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者有21 例，為Ⅲ～Ⅳ期的患者有32 例；其中發生淋巴結轉移的患者有29 例，未發生淋巴結轉移的患者有24 例。

1.2 方法

采用聚合酶鏈反應單鏈構象多態性分析法對這53 例患者進行p53 基因點突變檢測，方法為：用石蠟包埋患者的病理組織，并做成石蠟標本。將石蠟標本切成2 張6 ～8 μm厚的薄片，將切好的薄片置入試管中。對薄片進行常規脫蠟處理。將處理后所得的液體進行離心處理。將離心后獲取的上清液作為標本，并放在室溫下干燥10 ～20 min，加入適量的消化液及蛋白酶K，然后加入等體積的氯仿與異戊醇的混合溶液對標本進行提取，再加入適量的醋酸鈉。在零下20℃對標本進行過濾及15 min 的離心，取上清液。向上清液中加入適量的TE 緩沖液，以溶解其中的DNA，并放入4℃冰箱中保存。取含有200 ngDNA 的上清液（用紫外分光光度計測定DNA 的含量）作為反應模板。設計擴增p53 基因外顯子引物的方案（擴增第5 外顯子上游引物的順序 為5’-TTCCTCTTCCTGCAGTACTCC-3’，擴 增 第5 外顯子下游引物的順序為5’-GCCCCAGCTGCTCACCATCG-3’；擴 增 第6 外 顯 子 上 游 引 物 的 順 序 為5’-CACTGATTGCTCTTAGGTCG-3’，擴增第6 外顯子下游引 物 的 順 序 為5’-AGTTGCAAACCAGACCTCAGG-3’；擴 增 第7 外 顯 子 上 游 引 物 的 順 序 為5’-TCTCCTAGGTTGGCTCTGAC-3’，擴增第7 外顯子下游引物的順序為5’-GAAGTGGCTCCTGACCTGGA-3’；擴 增 第8 外 顯 子 上 游 引 物 的 順 序 為5’-CCTAATCCTGAGTAGTGGTAA-3’，擴增第8 外顯子下游引物的順序為5’-GTCCTGCTTGCTTACCTCG-3’）。將反應模板加入滅菌的液體石蠟油中，以預防反應模板出現蒸發現象。對反應模板進行10 min 的預變性，加入冰塊及Taq 酶后置在冰上。對反應模板進行30″的離心處理，取沉淀物按照設計的方案進行p53 基因外顯子擴增，擴增后放置在冰上。然后，對沉淀物進行非變性聚丙烯酰胺電泳，加入銀染用溶液，根據顯示出DNA 帶紋可確定是否存在p53 基因點突變的情況。每一例標本均取相應位置的正常肺部組織作為對照。

1.3 觀察指標

觀察這53 例患者發生p53 基因點突變的情況及發生p53 基因點突變與其病理分期及淋巴結轉移的相關性。

1.4 統計學方法

對本次研究中的數據均采用SPSS 21.0 統計軟件進行處理，計量資料用均數±標準差（± s）表示，采用t 檢驗，計數資料用百分比（%）表示，采用χ2 檢驗。以P ＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 這53 例患者發生p53 基因點突變的情況

在這53 例患者中，有27 例患者發生p53 基因點突變（其中有15 例患者發生p53 基因第5 外顯子突變，有2 例患者發生p53 基因第6 外顯子突變，有10 例患者發生p53基因第8 外顯子突變），發生p53 基因點突變患者的占比為50.9%；有26 例未發生p53 基因點突變，未發生p53 基因點突變患者的占比為49.1%。

2.2 這53 例患者發生p53 基因點突變與其臨床病理生理特征的相關性

在這53 例患者中，病理分期為Ⅰ～Ⅱ期的非小細胞肺癌患者p53 基因點突變的發生率低于病理分期為Ⅲ～Ⅳ期的非小細胞肺癌患者，P ＜0.05 ；發生淋巴結轉移的非小細胞肺癌患者p53 基因點突變的發生率高于未發生淋巴結轉移的非小細胞肺癌患者，P ＜0.05。詳見表1 和表2。

表1 這53 例患者中不同病理分期的患者發生p53 基因點突變的情況[n（%）]

表2 這53 例患者中淋巴結轉移及未轉移患者發生p53 基因點突變的情況[n（%）]

3 討論

癌基因的變化及抑癌基因的變化在癌細胞發生惡性轉變的過程中起著重要的作用。有研究資料顯示，小細胞肺癌患者及非小細胞肺癌患者均存在p53 基因點突變的情況。在本次研究中，采用聚合酶鏈反應單鏈構象多態性分析法對非小細胞肺癌患者進行p53 基因點突變檢測時，標本p53基因的第6 外顯子擴增產物在201bP 區域出現DNA 條帶，第7 外顯子擴增產物在171bP 區域出現DNA 條帶，獲得的這兩條DNA 條帶的高度與設計的條帶高度一致。這說明擴增p53 基因外顯子成功。對非小細胞肺癌患者進行p53 基因點突變檢測時使用不同的變性液（如堿變性液、甲酰胺變性液及氫氧化甲基汞變性液）對同一擴增產物進行電泳的結果發現：1）堿變性液處理獲得的帶紋較弱。2）甲酰胺變性液及氫氧化甲基汞變性液處理獲得的帶紋較為接近設計的帶紋。3）使用8% 氫氧化甲基汞變性液、10% 氫氧化甲基汞變性液及8%氫氧化甲基汞變性液處理獲得的條帶較清晰。p53 基因是一種能與DNA 進行特異性結合的蛋白質。p53 基因具有阻滯細胞周期（G1 期～G2 期）、誘導細胞凋亡、加速細胞分化的作用。p53 基因的突變及失活可促進腫瘤的發生及發展。野生型p53 基因對細胞周期起到負性調節作用，能夠抑制細胞的過度生長。突變型p53 基因可抑制細胞的生長，促進細胞的轉化，進而可導致腫瘤的發生。有相關研究顯示，p53 基因突變的發生存在于大多數腫瘤的發生及發展的過程中[3]。腫瘤組織發生p53 基因異常的主要原因有基因缺失、基因重組、基因突變等。常見的p53 基因突變為點突變。p53 基因發生突變時可喪失抑制腫瘤生長的功能。進行p53 基因突變檢測的方法有免疫組化法、化學酶切法、聚合酶反應單鏈構象多態性分析法等。有學者指出，采用免疫組化法對癌組織的DNA 進行p53 基因突變檢測的陽性率較高[4-5]。這可能是由于p53 基因的半衰期非常短，進行檢測時腫瘤組織中的p53 基因是發生突變后的基因。有研究資料顯示，采用聚合酶反應單鏈構象多態性分析法對腫瘤組織進行p53 基因突變檢測的敏感度為81 ～92%。約有50% 的非小細胞癌患者及約有75% 的小細胞癌患者可發生p53 基因突變。p53 基因突變位點多發生在DNA 序列的保守區域中。本次研究的結果顯示，在這53 例患者中，有27 例患者發生p53 基因點突變，發生p53基因點突變患者的占比為50.9%；有26 例未發生p53 基因點突變，未發生p53 基因點突變患者的占比為49.1%。這53 例患者中病理分期為Ⅰ～Ⅱ期的非小細胞肺癌患者p53基因點突變的發生率低于這53 例患者中病理分期為Ⅲ～Ⅳ期的非小細胞肺癌患者，P ＜0.05 ；發生淋巴結轉移的非小細胞肺癌患者p53 基因點突變的發生率高于未發生淋巴結轉移的非小細胞肺癌患者，P ＜0.05。從本次研究的結果可以看出，隨著非小細胞肺癌患者病情的加重，其p53 基因點突變的發生率升高。

綜上所述，p53 基因點突變的發生與非小細胞肺癌患者的病理分期及淋巴結轉移的情況具有相關性。