致病性大腸桿菌誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜炎模型建立

孫凱鑫 ，王友元，石麗穎，李前慶，劉紅羽，趙 靜，王 軍*，呂文發(fā)*

（1.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國際合作聯(lián)合實驗室，吉林長春 130118；2.動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林長春 130118）

子宮內(nèi)膜炎是因子宮內(nèi)膜感染而引起的炎癥，會延遲繁殖周期并降低動物的生產(chǎn)能力，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。產(chǎn)后生殖道擴張，細菌等病原微生物感染均可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎發(fā)生，其中細菌感染是子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的主要誘因[3-4]。大腸桿菌是引起子宮內(nèi)膜炎的常見致病菌，其作為革蘭氏陰性菌，外壁層包含著大量脂多糖，而脂多糖是炎性細胞的主要激活物，可誘導(dǎo)中性粒細胞激活，導(dǎo)致炎性細胞因子的產(chǎn)生與釋放[5]。炎癥反應(yīng)的特征主要包括炎性介質(zhì)和細胞因子的大量產(chǎn)生，而細胞因子中促炎和抗炎的穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致炎癥持續(xù)性產(chǎn)生并使組織破壞引起疾病[6]。研究表明，炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生受核因子κB（NF-κB）的影響[7]。NF-κB信號通路激活可通過上調(diào)促炎細胞因子白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[8-9]。為進一步探究大腸桿菌誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜炎癥的發(fā)生，本研究向小鼠子宮內(nèi)灌注致病性大腸桿菌（EPEC）建立小鼠子宮內(nèi)膜炎模型，并通過檢測組織病理學(xué)變化、炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α及NF-κB 蛋白表達以驗證模型是否建立成功，進一步探究大腸桿菌誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎的損傷機制，為子宮內(nèi)膜炎的治療提供一定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 本試驗選擇8～10 周齡、體重30～35 g的SPF 級健康ICR 雌性小鼠24 只，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0001。

1.2 試驗儀器 微量移液器（10～100 μL，德國 Eppendorf）、石蠟切片機、分析天平（ME104E，梅特勒）、恒溫恒濕箱（HPX-160BSH-III，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、光學(xué)顯微鏡（BA410E，Motic Europe）、超凈工作臺（HS-840u，蘇州凈化設(shè)備有限公司）、實時熒光定量PCR 儀（Mx3000P，上海吉泰生物科技有限公司）、梯度PCR 儀（Veriti，Thermo Fisher Scientific）。

1.3 細菌培養(yǎng) 致病性大腸桿菌（EPEC）由本實驗室提供。將凍存的大腸桿菌放至室溫，用接種環(huán)蘸取菌液在LB 固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線，恒溫箱37℃培養(yǎng)24 h后用接種環(huán)挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，純化3 次后予以備用。

1.4 子宮內(nèi)膜炎模型的建立 將24 只小鼠經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機分為4 組，每組6 只，3 個炎癥模型組分別使用留置針向小鼠子宮內(nèi)灌注1×106、1×108、1×1010CFU/mL 的大腸桿菌25 μL，對照組向小鼠子宮內(nèi)灌注等體積的生理鹽水，灌注24 h 后將所有小鼠剖檢并進行采樣。

1.5 病理組織切片染色 剖檢小鼠，取小鼠子宮角中段使用4%多聚甲醛固定1 周，埋在石蠟中制作石蠟切片，進行切片、脫蠟、水化和染色等過程制作HE 染色切片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠子宮組織的病理變化。

1.6 熒光定量PCR 根據(jù)NCBI 查找并設(shè)計小鼠的IL-6、IL-1β和TNF-α序列引物，均由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物信息見表1。Trizol 法提取小鼠子宮組織的RNA，按照TaKaRa 試劑盒將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR 檢測IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA 表達。熒光定量PCR 反應(yīng)體系：10 μL SYBR Premix Ex Taq II、6 μL ddH2O、上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，0.4 μL ROX reference Dye II，2 μL cDNA 模板。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，95℃復(fù)性15 s，擴增40個循環(huán)。

表1 引物信息

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實驗 小鼠子宮內(nèi)膜炎炎癥模型建立完成后，收集小鼠子宮，進行組織研磨。取1 g 組織，加入9 mL 的pH 為 7.2～7.4 的PBS，用手工或者勻漿器將標本勻漿充分。離心20 min（2 000～3 000 r/min），仔細收集上清。按照ELISA 說明書進行操作，檢測細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的變化，試劑盒為江蘇酶免實業(yè)有限公司提供。

1.8 Western Blot 測定NF-κB 蛋白表達 取小鼠子宮組織稱重0.1 g 研磨，BCA 法測定各組樣品蛋白濃度。使用SDS-PAGE電泳緩沖液將蛋白條帶跑開以獲得目的蛋白，使用轉(zhuǎn)膜液將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上（250 V、0.12 A、28 min）。將膜與封閉緩沖液37℃封閉2 h，加入一抗p65（1:1 000；Invitrogen）、p-p65（1:1 000；Invitrogen）、IκBα（1:1 000；Invitrogen）、p-IκBα（1:1 000；Invitrogen）、β-actin（1:10 000；Invitrogen）37℃ 孵育1.5 h。TBST緩沖液洗滌3 次后再加入二抗37℃孵育1 h，TBST 緩沖液洗滌3 次。最后使用Tanon Gis 軟件進行蛋白條帶的灰度值分析。

1.9 統(tǒng)計與分析 利用GraphPad Prism 5.0 軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結(jié)果均表示為平均值±標準誤，P＞0.05 表示無統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 和P＜0.001 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 炎癥模型小鼠子宮組織HE 染色 小鼠子宮組織HE 染色結(jié)果顯示（圖1），對照組小鼠的子宮組織結(jié)構(gòu)正常，子宮內(nèi)膜層與肌層界限分明，內(nèi)膜間質(zhì)細胞排列整齊，腺體大小均一，分布均勻，腺上皮及宮腔上皮完整。在1×106、1×108CFU/mL 大腸桿菌感染組中發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜層與肌層界限不清，腺體、宮腔上皮缺失，宮腔殘余面積狹小。而在1×1010CFU/mL 大腸桿菌感染組中，小鼠子宮內(nèi)膜層與肌層無明顯界限，子宮內(nèi)膜淺層上皮、腺腔和宮腔內(nèi)形成微膿腫和中性粒細胞浸潤。

圖1 不同濃度的大腸桿菌對小鼠子宮組織HE 染色比較（×100）

2.2 熒光定量PCR 檢測模型小鼠炎性因子的mRNA 表達如圖2 所示，使用1×106CFU/mL 大腸桿菌灌注小鼠子宮24 h 后，與對照組相比，1×106CFU/mL 組炎性因子IL-6 和TNF-α的基因水平顯著上升，1×108CFU/mL 組IL-6 和TNF-α的基因水平極顯著上升，1×1010CFU/mL組IL-6、IL-1β、TNF-α基因水平極顯著上升。

圖2 炎癥模型中炎性因子的基因表達水平

2.3 ELISA 檢測模型小鼠炎性因子的分泌 如圖3 所示，與對照組相比，向子宮內(nèi)灌注1×106CFU/mL 的大腸桿菌模型中IL-1β的分泌水平上升（P＜0.001），IL-6 和TNF-α分泌水平無變化。向子宮內(nèi)灌注1×108CFU/mL的大腸桿菌后，IL-1β和TNF-α分泌水平上升（P＜0.01），IL-6 的分泌水平無顯著變化。使用1×1010CFU/mL 的大腸桿菌24 h 后，IL-6（P＜0.01）、IL-1β（P＜0.001）和TNF-α（P＜0.01）3 種炎性因子的分泌水平均上升。

2.4 小鼠子宮組織中NF-κB 炎癥通路相關(guān)蛋白的表達通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測小鼠子宮組織內(nèi)的蛋白變化發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌處理激活了NF-κB 通路，IκB-α與p65 的磷酸化水平上升（P＜0.05），NF-κB 的活性被顯著激活，p-p65/p65（P＜0.01）和p-IκB-α/IκB-α（P＜0.05）表達量與對照組相比均上升（圖4）。

圖3 炎癥模型中炎性因子的蛋白分泌水平的變化

圖4 炎癥模型小鼠對NF-κB 信號通路表達的影響

3 討 論

子宮內(nèi)膜是分娩后抵御生殖道感染的第一道防線，主要發(fā)揮屏障作用[10-12]。細菌感染通常會促進免疫細胞的聚集并導(dǎo)致子宮的急性炎癥[13]。大腸桿菌誘發(fā)的子宮損傷呈典型的炎癥反應(yīng)，子宮組織有嚴重的炎性反應(yīng)，其特征是有膿腫形成和出現(xiàn)大量的白細胞浸潤[14]。本研究參考以往動物子宮內(nèi)膜炎模型的建立方法[15-16]，向小鼠子宮內(nèi)灌注1×1010CFU/mL 致病性大腸桿菌24 h后，通過檢測組織切片、炎性因子和炎癥通路的變化來確定炎癥發(fā)生，成功建立了小鼠子宮內(nèi)膜炎的病理模型。

炎癥是對病原體或內(nèi)源性信號分子釋放的先天免疫應(yīng)答的重要組成部分[17]。許多促炎細胞因子、趨化因子和黏附因子的產(chǎn)生被認為與疾病過程中的炎癥有關(guān)[18-19]。IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎細胞因子在產(chǎn)后早期子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[20]。IL-6 是感染和組織損傷后迅速產(chǎn)生的，它通過刺激急性期反應(yīng)，造血作用和免疫反應(yīng)來促進宿主防御[21]。白介素-1（IL-1）家族由幾種促炎或抗炎蛋白組成，其中最主要的炎癥介質(zhì)是IL-1β，可通過與IL-1 的受體1 結(jié)合而導(dǎo)致發(fā)燒和免疫活化[22]。TNF-α是與TNF 受體1（TNFR1）結(jié)合時的關(guān)鍵促炎性細胞因子[23]。本試驗中，利用1×1010CFU/mL的大腸桿菌灌注小鼠子宮24 h 后IL-6、IL-1β和TNF-α表達水平顯著性上升，說明大腸桿菌能夠引起炎癥相關(guān)細胞因子的合成釋放，從而導(dǎo)致子宮炎癥的發(fā)生。

NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子家族被認為是炎癥過程的主要介質(zhì)，是先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵參與者。在眾多轉(zhuǎn)錄因子中，NF-κB 是調(diào)節(jié)促炎性產(chǎn)生的最重要因子[24]。NF-κB 在炎癥反應(yīng)過程中對促炎介質(zhì)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS 和COX-2[25-26]。據(jù)報道，NF-κB 是調(diào)節(jié)涉及免疫和急性期炎癥反應(yīng)的各種因子表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[27]。本研究中，大腸桿菌增加了p-p65/p65 的蛋白水平，這表明大腸桿菌加強了NF-κB 的核轉(zhuǎn)運；大腸桿菌感染后子宮組織中p-IκB-α蛋白水平升高，p-IκB-α/IκB-α顯著高于對照組，這表明大腸桿菌激活了IκB-α向p-IκB-α發(fā)生轉(zhuǎn)變。本研究結(jié)果顯示，在小鼠子宮內(nèi)膜炎模型中，與對照組相比，大腸桿菌能夠通過引起細胞中的NF-κB 活化來增加促炎性介質(zhì)產(chǎn)生，與相關(guān)研究報道一致[28-29]。以上研究表明大腸桿菌能夠激活細胞中的NF-κB 來引起炎癥反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，使用濃度為1×1010CFU/mL 的大腸桿菌25 μL 灌注小鼠子宮24 h 后，可誘導(dǎo)小鼠的子宮發(fā)生炎癥，成功建立小鼠子宮內(nèi)膜炎模型。