原花青素在防控分泌性腹瀉中的研究進展

徐 靜，王 幸，雷 蕾，帥 柯,2，楊漢博,2*

（1.成都思來生物科技有限公司，四川成都 610041；2.四川農業大學動物醫學院，四川成都 611130）

原花青素又稱原花色素、縮合鞣質，是以黃烷-3-醇和黃烷-3，4-二醇（兒茶素或表兒茶素）為構成單元，以C-C 鍵結合方式聚合而成的一類黃酮化合物，普遍存在于花生衣、葡萄籽、松樹皮、高粱皮、龍血巴豆等植物中，已被證實具抗氧化、抗炎等功能[1-3]。近年來，原花青素的抗分泌性腹瀉功能被逐漸發現和確認。分泌性腹瀉是某些病原菌（如產腸毒素大腸桿菌、霍亂弧菌等）、病毒（如輪狀病毒）、炎癥過程、藥物、遺傳等因素引起腸液分泌增多為主要特征、伴有吸收障礙的腹瀉[4]。飼料中禁止添加抗生素、限量添加鋅等政策實施后，斷奶仔豬腹瀉率升高、耗料增重比升高等關聯性問題逐漸凸顯，特別是產腸毒素大腸桿菌導致的斷奶仔豬腹瀉問題嚴重影響養殖生產效率，養殖行業亟需可有效預控分泌性腹瀉的物質來解決該問題。本文就原花青素的生物活性、分泌性腹瀉和原花青素抗分泌性腹瀉機制等方面做一綜述，旨在為防控斷奶仔豬分泌性腹瀉提供理論依據。

1 原花青素的結構與生物活性

1.1 原花青素的結構 原花青素的基本構成單元為黃烷-3-醇和黃烷-3，4-二醇（以兒茶素或表兒茶素為主），是典型的C6-C3-C6結構的黃酮化合物。兒茶素或表兒茶素通常以C4-C8或C4-C6鍵聚合。根據聚合度不同，原花青素可分為低聚原花青素（聚合度2～5）、聚合原花青素（聚合度＞5，但仍易溶于水）和高聚原花青素（聚合度很高，且難溶于水）[1,3]。不同植物來源的原花青素含量、聚合度差異較大。Yamakoshi 等[5]研究表明，葡萄籽中原花青素含量為2%～8%（以葡萄籽干重計），其中低聚原花青素可達25%。劉睿等[6]研究發現，高粱皮中原花青素含量為1%～4%，但基本上為高聚原花青素。

原花青素的性質主要取決于其聚合度的不同。原花青素含大量酚羥基，聚合度增大，收斂性能（與蛋白質結合生成不溶于水的鞣酸蛋白）增強。不同聚合度的原花青素被腸道吸收的難易程度不同，聚合度越大，越難被吸收[7]。Dens 等[2]研究表明，原花青素聚合度為2～3 易被吸收、4～6 少量被吸收、7 以上則基本不被吸收。

1.2 原花青素的主要生物活性

1.2.1 抗氧化活性 原花青素是國際公認的抗氧化性極強的天然抗氧化劑，抗氧化活性是維生素E 的50 倍，是維生素C 的20 倍，尤其是體內抗氧化活性，是其他抗氧化劑難以媲美的[8]。原花青素的作用機制是其在體內釋放H+，競爭性地與自由基結合并反應，一方面，可保護脂質不被氧化，阻斷自由基鏈式反應；另一方面，經反應后產生的半醌自由基再通過親核加成反應生成具有兒茶酸及焦酚結構的聚合物，仍然具有很強的抗氧化活性[9-10]。

原花青素的抗氧化活性與濃度、聚合度、羥基位置、連接方式、空間構型、溶劑等等均有關系。其活性呈劑量-效應關系，當超出一定濃度范圍，其濃度升高，活性反而降低[8]。活性一般隨著聚合度增加而增加；C3位置的甲氧基化和糖基化會降低活性；C4-C8連接方式的活性大于C4-C6連接方式；以表兒茶素為單元的聚合后的活性大于以兒茶素為單元的聚合；在水相中活性增強，在油相中活性降低[11]。尹夢宇[12]選用ABTS、DPPH自由基清除法和鄰苯三酚自氧化法對原花青素進行了體外抗氧化性能測定，確證了原花青素具有顯著的體外抗氧化效果；選定人體內穩定且最具有代表性的8-羥基脫氧鳥苷DNA 作為檢測對象，并與維生素C+維生素E 片劑對比，原花青素的抗氧化效果優于維生素C+維生素E 組。

1.2.2 其他生物活性研究 除了抗氧化外，國內外學者對原花青素的活性展開了大量研究，主要包括降血脂、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗癌、調節血糖、神經系統性疾病、抗腹瀉等方面[13-17]。其中，原花青素在抗腹瀉上應用成果最為突出。2012 年，美國食品和藥品監督管理局（FDA）批準Fulyzaq（商品名為Crofelemer）用于治療AIDS 患者的腹瀉癥狀；Crofelemer 提取自大戟科龍血巴豆的紅色乳膠，是一種平均分子量約為2 200 ku 的多種原花青素單體的隨機聚合的產物[18]。Crofelemer 是FDA 批準的第二例植物藥，也是第一例口服植物藥，說明其安全性、有效性等方面均得到認可，對于中醫藥進入歐美市場和作為處方藥進入西醫體系均具有史無前例的意義。唐青松等[19]研究表明，飼糧中添加500 mg/kg 和1 000 mg/kg 的縮合單寧能夠提高斷奶仔豬生長性能和緩解腹瀉，腹瀉率分別降低7.72%和60.97%。

2 分泌性腹瀉的發生原因及其機制

2.1 分泌性腹瀉發生原因 分泌性腹瀉的發生原因主要分為感染性和非感染性兩類，其中感染性因素包括細菌感染（如可產生腸毒素的產腸毒素大腸桿菌或霍亂弧菌等，具有侵襲性的志賀氏菌或沙門氏菌等）、輪狀病毒感染、寄生蟲感染（溶組織性阿米巴、隱孢子蟲），非感染性因素包括藥物副作用（艾滋病、癌癥藥物性作用）、自身免疫性疾病（潰瘍性腸炎、克羅恩病）、先天性疾病（微絨毛包涵性疾病、家族性腹瀉）。分泌性腹瀉臨床癥狀主要表現為一般不發熱、稀水便、無明顯的白細胞增多，但伴有脫水、機體消瘦等癥狀，脫水甚者易死亡[5,20]。

2.2 分泌性腹瀉發生機制 分泌性腹瀉發生機制與細胞內介質（cAMP、cGMP、Ca2+）濃度升高而引起的水和電解質分泌增多、吸收受抑制有關。

產腸毒素大腸桿菌（ETEC）、霍亂弧菌主要是通過升高細胞內cAMP 或cGMP 濃度引發分泌性腹瀉。ETEC 生長過程中可產生熱敏性腸毒和（或）耐熱性腸毒素，而霍亂弧菌生長過程中可產生霍亂毒素。巧合的是，熱敏性腸毒素與霍亂毒素在空間結構上具有高度相似性，均為大分子蛋白，由A、B 亞基組成，A 亞基為毒性基團，B 亞基為受體識別基團。首先，B 亞基與腸上皮細胞神經節苷脂GM1 受體識別并結合，經飽飲或其他作用進入細胞，并在內質網將A、B 亞基分離。然后，A 亞基具有ADP-核糖基化轉移酶活性，催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）轉化成核糖基化腺嘌呤二核苷酸（ADP-R），ADP-R 激活興奮性G 蛋白（Gsα蛋白）。最后，腺苷酸環化酶被Gsα蛋白激活，并催化三磷酸腺苷（ATP）轉化為環磷酸腺苷（cAMP），cAMP 濃度大幅升高，引發蛋白激酶A（PKA）破壞囊性纖維化跨膜調節傳導（CFTR）通道，使氯離子、水分大量外流進入腸腔，超過正常的吸收能力，即發生分泌性腹瀉[21]。耐熱性腸毒素與熱敏性腸毒素、霍亂毒素有類似致瀉途徑，但不同的是，耐熱性腸毒素與腸上皮細胞神經節苷脂GM1 受體結合后，激活的是腸上皮細胞的鳥苷酸環化酶，促使細胞漿中三磷酸鳥苷（cGMP）水平上升，最終引發分泌性腹瀉[22]。熱敏性腸毒素、霍亂毒素和耐熱性腸毒素引發的分泌性腹瀉常伴隨嚴重脫水，特別是熱敏性腸毒素和霍亂毒素是至今發現的最劇烈的致瀉毒素，動物發病后，若不及時救治，極容易出現脫水、機體消瘦，甚至死亡現象。

志賀氏菌、沙門氏菌主要是通過升高細胞內Ca2+濃度引發分泌性腹瀉。志賀氏菌或沙門氏菌侵襲進入腸上皮細胞后，刺激免疫細胞分泌IL-6、IL-8 和腫瘤壞死因子，引起細胞內Ca2+濃度升高，Ca2+濃度升高不僅會使鈣激活氯離子通道大量分泌氯離子，還會抑制鈉氫交換蛋白（NHE3），減少鈉離子吸收，最終電解質大量丟失，水分外流，發生分泌性腹瀉[23]。

輪狀病毒也主要是通過升高細胞內Ca2+濃度引發分泌性腹瀉。輪狀病毒進入細胞后，其非結構蛋白4（NSP4）識別整合素α1β2，并在腸神經作用下使Ca2+濃度升高，Ca2+濃度升高除了使鈣激活氯離子通道大量分泌氯離子和抑制NHE3 外，還會抑制鈉-葡萄糖共同轉運蛋白（SLC5A1），減少鈉離子吸收，最終，電解質和水分大量丟失，發生分泌性腹瀉[24]。

另外，受到各種因素的刺激，腸道內源性腦啡肽酶、炎癥過程中產生的血管活性肽（VIP）和5-羥色胺（5-HT）、鈣-鈣調節蛋白、P-物質等，也會間接使cAMP、cGMP 或Ca2+的濃度升高，引發分泌性腹瀉。例如，內源性腦啡肽（一種腸道內源性阿片肽，在小腸中有促吸收和抗分泌的作用）與腸道基膜δ受體結合，直接抑制腺苷酸環化酶的活性，但可被內源性的金屬蛋白酶—腦啡肽酶快速降解為亮-腦啡肽和蛋-腦啡肽，降解物失去促吸收和抗分泌作用，發生分泌性腹瀉[25]。

2.3 斷奶仔豬腹瀉與分泌性腹瀉的關系 由于仔豬斷奶后胃腸道、免疫功能尚未發育健全，加之換料、轉群、應激等因素影響腸道完整性及其正常功能導致的腹瀉，即非感染性腹瀉[26]；更重要的是由于感染以ETEC 為代表病原而發生的腹瀉，即感染性腹瀉。ETEC 導致腹瀉的流程大致分為2 個過程：第一步，ETEC 的菌毛（黏附素）可識別腸上皮細胞受體，并黏附到腸上皮細胞上；第二步，ETEC 生長過程中產生腸毒素，特別是熱敏性腸毒素，會迅速引發分泌性腹瀉。黏附素、內毒素和腸毒素被認為是ETEC 致瀉三要素，黏附素本身并無毒性，主要是將菌毛與腸上皮細胞黏附，以便于增殖；內毒素在腸道發生損傷的情況下才能吸收入血，僅當超過肝臟的解毒能力時才誘發炎癥；而腸毒素則是直接作用腸道上皮細胞致瀉，且該作用劇烈[27-28]。所以，斷奶仔豬的感染性腹瀉主要是分泌性腹瀉。

3 臨床上抗分泌性腹瀉藥物現狀

目前，人醫或獸醫上已使用的治療分泌性腹瀉藥物有洛哌丁胺、奧太曲、吩噻嗪、氯丙嗪、格列本脲、口服補液鹽（ORS）、消旋卡多曲等。其中，洛哌丁胺、ORS、消旋卡多曲應用最廣。原花青素則是FDA 批準用于抗分泌腹瀉的新藥[17,25]。

洛哌丁胺主要通過抑制腸道運動、延長吸收時間來作用；奧太曲主要通過抑制促分泌素（如VIP 和5-HT）的釋放對神經內分泌瘤發揮作用；吩噻嗪和氯丙嗪主要通過抑制鈣-鈣調節蛋白，從而抑制激素刺激的cAMP效應；格列本脲能作用于氯離子通道，減少分泌。這幾類藥物在分泌性腹瀉的不同治療方案中均有價值，但存在副作用大、毒性大的風險，在適應癥、適應人群等方面上均有較大限制。

ORS 能有效補充機體損失的水和電解質治療脫水，是臨床上最重要的輔助治療手段，可降低腹瀉死亡率約70%，但它并不能減少體液的流失、大便量或不能縮短病程。消旋卡多曲是通過抑制腦啡肽酶活性來提高腸道腦啡肽活性，進而降低腸道隱窩細胞內cAMP、Ca2+在腸道黏膜的濃度，減少水、電解質的分泌，同時增加水、電解質的吸收，可減少體液的流失或縮短病程，與洛哌丁胺、奧太曲等藥物相比，具有效果確切、安全性高的特點，但其原料生產成本很高。原花青素來源于植物，經提取、分離、富集而成，成本更低、安全性更高。

4 原花青素抗分泌性腹瀉的機制

原花青素抗分泌性腹瀉的機制研究主要集中在作為ADP-核糖基化抑制劑或氯離子通道抑制劑，阻斷分泌性腹瀉發生途徑中某些環節。

4.1 ADP-核糖基化抑制作用 原花青素可抑制霍亂毒素或熱敏腸毒素A 亞基的ADP-核糖基化轉移酶活性，阻斷NAD 轉化成ADP-R，抑制后續引發的腹瀉效應，即原花青素抑制了ADP-核糖基化作用。也就是說，A亞基相當于產腸毒素細菌引發分泌性腹瀉的“啟動器”，而原花青素可以在它剛啟動之初就“失靈”。野田公俊等[29]采用胍丁胺分析法表明，聚合度2～6 的原花青素可不同強度地抑制霍亂毒素催化ADP-核糖基化胍丁胺的生成，其表征方法是測定[腺嘌呤-14C]ADP-核糖基化胍丁胺的放射活性，而兒茶素單體卻沒有該抑制作用，且蘋果、大黃、葡萄籽等不同來源的原花青素均具有該作用；兔回腸結扎法試驗進一步表明，50 μg 原花青素可完全抑制由1 μg 霍亂毒素引起結扎腸道（10 cm）的體液積累。

4.2 抑制氯離子通道作用 原花青素抗分泌作用機制涉及靶向和抑制2 種不同的腸氯化物通道，即作為cAMP刺激的氯離子通道的CFTR 通道和CaCC 的抑制劑[30]。氯離子通道可認為是引發水、電解質外流的最后關卡，而原花青素 “鎮守最后一道門”。Tradtrantip 等[31]研究證實，Crofelemer 抑制了CFTR 通道，最大抑制率接近60%，IC50 為7 μmol/L，并在CFTR 的細胞外位點產生的電壓依賴性阻滯作用使通道閉合狀態穩定，且在4 h 后最大抑制率仍保持30%以上（逆轉小于50%）；進一步研究發現Crofelemer 通過與電壓無關的抑制機制強烈抑制CaCC TMEM16A，最大抑制率＞ 90%，IC50為6.5 μM；Crofelemer 對2 個結構無關的腸道Cl-通道的雙重抑制作用可解釋其腸道抗分泌活性。Poorvi[32]認為，Crofelemer 用于緩解HIV 感染者接受抗逆轉錄病毒療法（ART）的非感染性腹瀉癥狀，確認其機制正是通過阻斷胃腸腔中的氯離子通道來抑制氯離子的分泌，且具有耐受性好和安全性好的優勢。Crutchley 等[33]、Jessica 等[34]試驗表明，Crofelemer 可有效減少旅行者腹瀉、霍亂等感染性腹瀉患者的水樣便量，并顯著縮短病程時間，口服耐受性好。也就是說，Crofelemer 可以同時應用于非感染性和感染導致的分泌性腹瀉。需要說明的是，Crofelemer（SP-303）是聚合度為3～30、平均分子量2 200 ku 的原花青素。而Fisher 等[35]采用來源相同、未分離純化、主要成分占SP-303 質量67%、平均分子量為3 000 ku 的SB-303 與SP-303 對比的結果顯示，SB-303 也具有抗分泌腹瀉的活性，雖然效果略弱于SP-303，但提取工藝和成本大幅減少，這為對純度要求不太高的領域（如飼料）具有很高的開發價值。

5 展 望

動物不發病或少發病是提高養殖生產效率的重要途徑之一，而斷奶仔豬感染性腹瀉防控工作一直是生豬養殖的痛點和難點。原花青素是通過抑制腸毒素或其他物質導致的分泌亢進的某個環節或多個環節來實現抗分泌性腹瀉的。需要注意的是，單獨使用原花青素可在一定程度上控制分泌性腹瀉，但保證腸黏膜正常結構完整與功能也是抗分泌性腹瀉的基礎條件。因此，原花青素與腸黏膜保護物質的組合使用將會是未來抗分泌性腹瀉的重要手段。