無PAM限制的CRISPR/Cas9系統構建及效率驗證

秦懷遠，李和剛，張 寧，辛京京，趙金山

（青島農業大學動物科技學院，山東青島 266109）

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）源于Ⅱ型微生物適應免疫系統，在該系統中細菌會通過入侵噬菌體和質粒來破壞基因組信息保護自己[1]。當病毒侵入個體，會釋放出病毒DNA，當細菌檢測到病毒DNA 存在時會釋放出2 種RNA，其中sgRNA 與病毒DNA 相結合配對，另一種RNA 指導合成Cas9 蛋白并與sgRNA 組成復合物，從而切斷病毒DNA 使其失效[2-3]。CRISPR/Cas9 系統需要通過識別在Cas9 靶位點上的一個原間隔子相鄰基序（PAM）[4-6]序列進行特異性靶向基因編輯。目前廣泛使用的化膿性鏈球菌SpCas9 識別的PAM 為NGG（N為任意堿基，G 為鳥嘌呤），也就是說它僅僅能識別靶向基因組中1/16 的位點[7]，所以NGG 的PAM 并不能滿足對廣譜基因的編輯需求，因此研究者們試圖通過降低PAM 對CRISPR/Cas9 使用的限制，來拓寬CRISPR/Cas9 系統的編輯范圍。

Kleinstiver 等[8]在野生型SpCas9 的基礎上，進行R1335V/L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R/T1337R 7 個位點的定點突變，成功構建出了PAM 僅為NG的Cas9 突變體SpCas9-NG。Hu 等[9]運用噬菌體輔助持續演化（Phage-Assisted Continuous Evolution，PACE）[10]的方法來進化并拓展其識別的PAM 序列獲得了xCas9。xCas9 比SpCas9 有更高的DNA 靶向特異性，而且將PAM 的限制也降至了NG。Liu[11]團隊證實xCas9 在兔子中具有擴展PAM 兼容性和增強的堿基編輯效率，可用于生物體中的精確基因修飾。而Chatterjee 等[12]發現一種SpCas9 的直系同源物，來自犬鏈球菌的ScCas9，其與SpCas9 具有89.2%的同源性，在CRISPR/Cas9 晶體REC3 結構域[13-14]中，于367 至376 位插入了10 個帶正電荷的氨基酸（IKHRKRTTKL），并且在1 337 和1 338 位置上插入了另外2 個氨基酸（KQ）[15]，最后PAM 進一步放寬至NNGN，而且也有較強的靶向切割活性。這些發現進一步拓展了CRISPR 系統的靶向范圍。

雖然上述研究已經將CRISPR/Cas9 的PAM 限制降低至NG（SpCas9-NG、xCas9 等）以及NNG（ScCas9 等），但是想要更加徹底地使用CRISPR/Cas9 進行全基因組的無限制基因編輯，就必須進一步降低PAM 的限制。所以，在本實驗中，ScCas9 在有關控制PAM 的結構域中多出12 個氨基酸，在野生型SpCas9 氨基酸序列的基礎上，引入ScCas9 的氨基酸序列特點（插入特定的12 個氨基酸），期望可以將野生型的SpCas9 的NGG PAM 降低至ScCas9 的NNG PAM；同時在SpCas9-NG 和xCas9 氨基酸序列的基礎上，引入ScCas9 的氨基酸序列特點（插入特定的12 個氨基酸），期望能將SpCas9-NG 或xCas9 的PAM（NGN）限制徹底消除。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 迪慶綿羊皮膚成纖維細胞（DQSHS1）購自中國科學院昆明動物研究所，目錄號：KCB90012S；pX330（編碼野生型SpCas9）質粒購自Addgene 公司，貨號：#42230，pX330-NG（編碼SpCas9-NG）、pX330-xCas9（編碼xCas9）質粒由本實驗室在pX330基礎上構建而成；SSA-DKK2 報告載體由本實驗室保存；BbsI 限制性內切酶購自NEB 公司，貨號：R3539S；DH5α感受態細胞購自TaKaRa 公司，貨號：AIG1025A；T4 DNA 連接酶購自天根生物公司，貨號：B0202S；DNA 膠回收試劑盒購自天根生物公司，貨號：DP209-02；去內毒素質粒提取試劑盒購自OMEGA 公司，貨號：D6948-01；Lipo 3000 脂質體購自美國Invitrogen公司，貨號：L3 000015；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京原平皓生物科技有限公司，貨號：LF103-01；DNA 寡核苷酸由擎科公司合成。

1.2 載體構建

1.2.1 向導RNA 通用表達載體pCas9-sgRNA 設計與構建 向導RNA 通用表達載體pCas9-sgRNA 載體依次包含如下元件：

U6 啟動子：

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTG CATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGG AATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACA AAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGT AGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACT ATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATT TCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAAC ACC

spacer 克隆位 點（2 個反向 的BbsI 位 點，2 個BbsI 位點之間插入330 bp 隨機序列）：

GGGTCTTCG

GGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGT GGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTC TGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTT GTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGC CGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATG CGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTC GGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGA AGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATG GCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGT CGGGGTAGCGGCTGAAGCA

AGAAGACCT

sgRNA 下游序列：GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAA AAAGTGGCACCGAGTCGGTGC

U6 終止子：TTTTTT

bGH polyA：

CTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCT TCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCC CGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCA CTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCG CATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGG TGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTG GGAAGAgAATAGCAGGCATGCTGGGGA

把上述序列插入到pUC57 的EcoR V 位點，此過程委托青島擎科生物技術有限公司完成。

1.2.2 靶標的設計與載體構建 在綿羊基因庫中找出綿羊DKK2基因（NC_040257.1，21620923～21621362，440 bp），并將其第一外顯子編碼復制出來，設計NNG PAM、NNN PAM 的靶標，合成相應的寡核苷酸，其序列信息如表1，引物委托青島擎科生物技術有限公司合成。

將NNGT1、NNGT2、NNGT3、NNNT1、NNNT2、NNNT3 的上游引物和下游引物兩兩退火，在PCR 儀中進行退火過程。退火條件設定為95℃ 5 min，72℃ 10 min，后置于冰上，得到6 條雙鏈寡聚核苷酸。

使用BbsI 內切酶對pCas9-sgRNA 通用表達載體在37℃恒溫培養箱進行3 h 的酶切，其中酶切體系為50 μL：5 μL Buffer、2 μL 內切酶、28 μL 超純水，15 μL pCas9-sgRNA。將酶切產物進行凝膠電泳確定切開后，對酶切產物的3 300 bp 條帶進行切膠回收實驗，將6 條退火的雙鏈寡核苷酸與膠回收產物用T4 連接酶在4℃冰箱進行過夜連接，其中連接體系為10 μL：4 μL 退火引物，4 μL 酶切產物，1 μL T4 連接酶，1 μLBuffer；次日將所得連接產物用DH5α進行轉化，涂板，并將培養皿放置于37℃培養箱進行過夜培養。

表1 DNA 寡核苷酸序列

挑取單菌落加入到含有1 mL LB（含50 mg/mL 氨芐青霉素）的1.5 mL 離心管中，37℃ 200 rpm 搖菌7～8 h，分別使用NNGT1、NNGT2、NNGT3、NNNT1、NNNT2、NNNT3 的上游引物與特異性反向引物X2-R 進行菌落PCR 擴 增，其中PCR 反應體系為25 μL：22 μL 金牌mix、1 μL 上游引物、1 μL X2-R、1 μL 菌液。PCR 反應參數為熱蓋105℃，95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，上述過程循環29 次，72℃ 5 min，16℃保存。檢測相應單菌落，擴增后通過凝膠電泳，篩選120 bp 左右條帶的陽性菌落送往青島擎科生物技術有限公司進行測序驗證（測序引物為X2-R）。

1.2.3 SpCas9-NNG、ngCas9NNN、xCas9NNN 突變體的構建 在原有的野生型SpCas9、突變體SpCas9-NG 和xCas9 的基礎上，進一步進行ScCas9 中的12 個氨基酸序列的插入。野生型SpCas9、突變體SpCas9-NG 和xCas9 對應的表達Cas9 蛋白的氨基酸序列，在367 位置插入IKHRKRTTKL 十肽，在1 337、1 338 2 個位點插入KQ 二肽。此過程委托青島擎科生物技術有限公司完成。

1.3 細胞轉染 取生長狀態良好的綿羊成纖維細胞，先將細胞進行穩定培養傳代，在3～5 代細胞生長活性較強時進行24 孔板的鋪板。在孔內細胞密度達到75%左右時進行細胞瞬時轉染。本次實驗分SpCas9-NNG、ngCas9NNN 和xCas9NNN 3 個部分，每個實驗有4 組，分別為對照組和3 個實驗組，3 個實驗組分別由pCas9-sgRNA NNNT1、pCas9-sgRNA NNNT2、pCas9-sgRNA NNNT3 與突變體、SSA-DKK2 表達載體進行共轉染，將未連接sgRNA 的空白通用表達載體pCas9-sgRNA與突變體、SSA-DKK2 表達載體作為對照組，該實驗采用單一變量法，對照組加未連接靶標引物的pCas9-sgRNA 通用表達載體。其他實驗組分別加入pCas9-sgRNA T1、pCas9-sgRNA T2、pCas9-sgRNA T3。實驗在不同代數的細胞重復轉染2 次，轉染48 h 后，進行雙熒光素酶活性的測定，以達到驗證3 種突變體是否具有切割活性的目的。

1.4 雙熒光素酶報告基因檢測

1.4.1 細胞裂解 將轉染48 h 后的24 孔板中的培養基吸出來，每孔加入100 μL PBS 進行潤洗，重復2 次，除去死掉的細胞以及雜質。每孔加入100 μL 稀釋好的細胞裂解液，常溫靜置30 min 進行裂解。

1.4.2 螢火蟲熒光素酶活性測定 將裂解好的細胞進行柔和吹打混勻，取100 μL Luciferase Assay Reagent 加入Promega GloMax 20/20 發光檢測儀測定管底部，加入20 μL 待測樣品（裂解好的細胞），輕輕混勻后，放入儀器中進行檢測。

1.4.3 海腎熒光素酶活性測定 螢火蟲熒光素酶活性測定之后，直接向取出的離心管中加入100 μL 的終止液SR，輕柔吹打混勻后，放入儀器進行檢測，Stop Reagent 可以立即終止螢火蟲熒光素酶發光，并且同時啟動海腎熒光素酶發光反應。記錄海腎熒光素酶反應強度（RLU2）與螢火蟲熒光素酶反應強度（RLU1）的數值，計算2 組數據的比值，即RLU2/RLU1（簡寫為R2/R1）。

1.5 統計分析 將雙熒光素酶活性檢測結果數據RLU1、RLU2 記錄下來，并計算R2/R1，記錄于Excel 表格中，計算試驗組3 組的平均值，然后使用t 檢驗對各組結果差異顯著性進行分析（將試驗組與對照組進行比較，試驗組之間不做對比），P≤0.01 為差異極顯著，P≤0.05為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 引物退火 如圖1 所示，兩條單鏈寡聚核苷酸鏈通過退火，配對形成一條20 bp 的雙鏈寡聚核苷酸鏈，通過凝膠電泳，1～6 個孔均為明亮單一條帶，說明引物退火成功。

圖1 引物退火結果

2.2 pCas9-sgRNA 酶切如 圖2 所示，pCas9-sgRNA 空載體通過BbsI 酶切，產生3 300 bp、300 bp 2 條帶，切膠回收3 300 bp 條帶。

圖2 pCas9-sgRNA 酶切結果

2.3 菌液PCR 及測序結果 NNG、NNN 各有3 對退火引物的連接產物，每組挑5 個單個菌落進行菌液PCR，PCR結果通過凝膠電泳檢測，結果見圖3-A，1～15 為pCas9-sgRNA NNGT1，pCas9-sgRNA NNGT2 以及pCas9-sgRNA NNGT3，其中只有11 顯陰性，其余全為陽性，挑選4、5、8、9、12、13 送至青島擎科生物技術有限公司進行測序。圖3-B 中，1～15 為pCas9-sgRNA NNNT1、pCas9-sgRNA NNNT2 以及pCas9-sgRNA NNNT3，其中4、5、7、10、14、15 號孔電泳條帶單一明亮，顯示為陽性，送至青島擎科生物技術有限公司進行測序。

圖3 菌液PCR 鑒定結果

2.4 pCas9-sgRNA 靶標載體構建結果 如圖4 所示，A、B、C、D、E、F 測序峰圖表明，靶標均準確連入通用表達載體pCas9-sgRNA 上，NNG、NNN 2 種PAM 的靶標載體pCas9-sgRNAT1、pCas9-sgRNAT2、pCas9-sgRNAT3 構建完成。

圖4 靶標載體測序峰圖

2.5 雙熒光素酶檢測結果 雙熒光素酶檢測后，將實驗組結果與對照組進行SPSS 分析，對照組無sgRNA 進行引導，所以ngCas9NNN 突變體無切割效率，而實驗組ngCas9NNN 突變體在sgRNA 的引導下，對目的基因進行了有效的靶向切割，如圖5-A 所示，實驗組1、2 與對照組相比差異極顯著；實驗組3 與對照組相比差異顯著。結果說明ngCas9NNN 突變體有顯著的DNA雙鏈切割活性。

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如圖5-B 所示，xCas9NNN 突變體試驗，與對照組進行的雙熒光素酶檢測結果對比，只存在一定的切割活性，但活性不高。

圖5 雙熒光素酶報告載體檢測法檢測結果

如圖5-C 所示，SpCas9-NNG 突變體試驗，與對照組進行的雙熒光素酶檢測結果對比，有一定切割活性，但是活性不高。

3 討 論

本研究針對在PAM 識別相關的結構域中，尋找與PAM 識別有關的關鍵位點，進行氨基酸的突變插入，沒有進行定點突變。實驗是在ScCas9、野生型SpCas9、xCas9 和SpCas9-NG 的基礎 上，將2 種Cas9 蛋白的PAM 限制特點進行中和，優勢互補，針對SpCas9-NG和xCas9，在第3 位PAM 的限制蛋白序列中，引入SpCas9-NG 和xCas9 的氨基酸序列特點，在第2 位PAM 的限制蛋白序列中，引入了ScCas9 的第2 堿基的相關蛋白結構域中的氨基酸取代組合，期望進一步擴大野生型SpCas9、xCas9、SpCas9-NG 的編輯范圍。

在晶體結構分析中，SpCas9 識別NGG，主要是通過R1333 和R1335 這2 個氨基酸分子結構側鏈與NGG PAM 的第2 位和第3 位的核堿基之間的氫鍵識別[16]。野生型SpCas9 的氨基酸序列中，E1219 位置上的谷氨酸與R1335 的精氨酸，在空間結構會形成一個雙齒鹽橋[17-18]，這個雙齒鹽橋保持了其對PAM 第3 位核堿基的識別穩定性，所以在xCas9 的氨基酸序列中，E1219的定點突變（E1219V）是xCas9 降低PAM 識別限制的至關重要的突變，它的存在降低了E1219 與R1335的鹽橋的空間作用力，使得R1335 在識別PAM 過程中的結構松動，放松對第3 位核堿基G 的識別，從而使xCsa9 的PAM 限制與野生型SpCas9 相比降至NG。而與野生型SpCas9 的氨基酸序列比較，其他6 個位點的突變則是為了使xCas9 的DNA 靶向特異性提高。

本研究中，SpCas9-NNG、ngCas9NNN 和xCas9NNN都是在野生型SpCas9、SpCas9-NG 和xCas9 的氨基酸序列基礎上，引入ScCas9 的氨基酸插入特點，最后得到突變體SpCas9-NNG、ngCas9NNN 和xCas9NNN。野生型SpCas9 的PAM 為NGG，只單純的加入12 個氨基酸，在E1219 位點沒有進行任何突變，所以可能不會破壞E1219 位置上的谷氨酸與R1335 的精氨酸之間的鹽橋作用力，而且沒有使Cas9 蛋白放松對第二位核堿基的識別，猜想可能由于野生型SpCas9 與ScCas9本身存在的差異，致使野生型SpCas9 僅僅通過插入12個氨基酸，并不能降低其對第2 位核堿基識別的放松。對于突變體ngCas9NNN 和xCas9NNN，這兩者本身的氨基酸序列也有著差別，其中在關鍵的1 219 位點上，兩者的氨基酸也有所不同，xCas9 在野生型SpCas9 基礎上將谷氨酸突變為纈氨酸（E1219V），而SpCas9-NG 則在野生型SpCas9 的基礎上將1 219 位的谷氨酸換成苯丙氨酸（E1219F）。而最近Walton 等[19]利用結構導向工程，通過一系列的氨基酸取代組合，從中細化和篩選2 種CRISPR/Cas9 突變體SpG 和SpRY，同樣是為了將PAM 的限制降低，SpG 和SpRY 在E1219的位置也都進行了定點突變，他們將谷氨酸換成谷氨酰胺（E1219Q），同樣破壞了鹽橋的作用力，目的都是為了減弱E1219 位置上的谷氨酸與R1335 的精氨酸之間雙齒鹽橋的作用力，但是突變的差異有可能反而對xCas9NNN 造成了其他的空間作用效果，而對于突變體SpCas9-NNG 與ngCas9NNN，SpCas9-NNG 本身在1 219位置沒有任何突變，保持著原始的鹽橋作用力，使其PAM 相關的結構域本身空間結構就比較堅固，空間作用力強，對于PAM 的特異性識別難以放松。所以，SpCas9-NNG 和xCas9NNN 切割活性的降低，是否因為控制PAM 關鍵結構域的突變差異造成，還有待進一步的實驗驗證。

而SpG 和SpRY 在原來NGG PAM 的基礎上[19]，進一步將PAM 的限制降低至NGN 和NRN，甚至在NYN 的位點也表現出了一定的編輯效率。其中除了在E1219 位置的突變特點外，在R1333 上也進行了大量的討論，R1333Q 是提高SpRY 切割活性的關鍵位點，這將是下一步提高SpCas9-NNG 和xCas9NNN 切割活性的重要提示。

本次轉染實驗利用的SSA-DKK2 報告載體在之前的多次實驗中都取得了穩定的效果[20]，為雙熒光素酶檢測[21]提供了驗證基礎。在結果分析中，僅對本次插入設計的SpCas9-NNG、ngCas9NNN 和xCas9NNN 進行了切割活性以及效率的驗證，是對無PAM 限制的CRISPR/Cas9 編輯系統的初探，而實驗結果也為進一步拓展CRISPR/Cas9 的應用范圍提供了理論參考，對于2 種突變體的靶向特異性、脫靶效率及應用范圍的驗證，還有待進一步探索。

4 結 論

在本實驗中，在野生型SpCas9、SpCas9-NG 和xCas9 氨基酸序列中引入了ScCas9 的氨基酸取代特點，最后得到突變體SpCas9-NNG、ngCas9NNN 和xCas9NNN。通過雙熒光素酶檢測報告得出的結果，ngCas9NNN 可以識別NNN PAM 的目的序列，并且可以進行有效切割。