綿羊ATF3 基因的生物信息學分析及其在營養剝奪應激下的表達變化

李俊玲，郭麗榮，郭田燕，秦 健，杜 榮*

（1.山西農業大學動物醫學學院，山西太谷 030801；2.山西農業大學實驗教學中心，山西太谷 030801；3.山西農業大學生命科學學院，山西太谷 030801）

應激最早由加拿大病理學家Hans Selye 提出，指動物機體在受到外界各種不良刺激時發生的非特異性應答反應[1]。營養應激是由于外界特殊的營養環境（營養過高或過低）導致細胞代謝失衡甚至紊亂而發生的應答反應[2]。營養應激中研究較多的是營養剝奪應激，禁食是一種慢性的營養不足，是指在8～12 h 或幾天內不攝入或攝入很少的熱量[3-4]。ATF3（Activating Transcription Factor 3）是cAMP-CREB 轉錄因子家族的一員，它可以被多種應激誘導表達[5]。ATF3 包含一個堿基區亮氨酸拉鏈（bZIP）結構，該結構與CREB或AP-1 順式調節元件結合，可根據細胞環境抑制或激活靶基因的轉錄[6-7]。在多種應激條件下，ATF3 會通過表達改變而發揮其作用。有研究表明，運動后小鼠骨骼肌ATF3表達量明顯升高[8]。ATF3 可防止應激誘導的小鼠造血干細胞衰竭[9]。ATF3 可參與斑馬魚視神經的再生，在斑馬魚脊髓損傷后12 h 和6 d 其mRNA 水平會明顯升高[10-11]。多項研究表明，在營養應激條件下肝臟ATF3 的表達會發生顯著改變。與未修改豆油組相比，給大鼠喂養含有10%的酯化豆油8 周后，其肝臟ATF3基因表達量升高[12]。通過比較新孵化小雞禁食48 h 和禁食后再喂養48 h 的肝臟轉錄組發現，后者ATF3 表達量更高[13]。禁食48 h 后再喂養標準飼料后的前17 h，小鼠肝臟中ATF3基因表達升高；禁食46 h 后再喂養含有α-淀粉或葡萄糖的瓊脂凝膠14 h，小鼠肝臟中ATF3基因表達量增加[14-15]。目前有關家畜ATF3 的研究相對較少。有研究表明，ATF3基因在延邊黃牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、后腿肌、眼肌、西冷、上腦和皮下脂肪10 個部位組織中均有表達，可能影響機體的脂肪沉積[16]。目前，針對綿羊ATF3 的研究還鮮見報道。因此，本實驗旨在對綿羊ATF3 的結構和特性進行一系列生物信息學分析，并通過qRT-PCR 檢測禁食條件下ATF3mRNA 的表達，利用Genomatix 軟件預測ATF3啟動子區調控元件，以了解綿羊ATF3 的分子特性并探討ATF3基因在綿羊營養剝奪應激條件下的表達變化及可能的表達調控原因，為進一步深入研究綿羊ATF3基因的表達調控及作用機制并發掘其應用潛能提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品采集 本實驗選用6 月齡、體重45 kg左右的6 只母羊，隨機分為正常組和禁食組，正常組常規飼養，禁食組禁食3 d。3 d 后分別采集6 只綿羊大腿部位的半腱肌組織，并迅速放于液氮中儲存。

1.2 主要儀器 電子分析天平產自奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；超凈工作臺產自蘇州安泰空氣技術有限公司；核酸蛋白濃度測定儀產自美國Thermo 公司；電泳儀電源、電泳槽產自北京六一儀器廠；96 孔溫度梯度PCR 儀、熒光定量PCR 儀、全自動凝膠成像系統均產自美國BIO-RAD 公司。

1.3 綿羊ATF3 蛋白的生物信息學分析 從NCBI 網站上下載綿羊ATF3 的蛋白序列，利用表1 中的生物信息學網站和軟件對其進行分析。

1.4 總RNA 提取及cDNA 合成 將綿羊骨骼肌置于裝有液氮的研缽中進行充分研磨，研磨后加入RNAiso Plus（TaKaRa）進行總RNA 提取。取少量RNA 進行核酸電泳檢測，鑒定RNA 是否降解，用核酸濃度測定儀檢測RNA 濃度。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）進行反轉錄。第一步需要先去除基因組DNA，反應體系和條件：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，Total RNA 4 μL，RNase Free dH2O 補至10 μL；42℃ 2 min，4℃ 2 min。第二步為反轉錄反應，反應體系和條件：步驟一反應液10 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer 4 μL，RNase Free dH2O 補至20 μL；37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 2 min。之后用核酸濃度測定儀檢測反轉錄后的cDNA 濃度。

1.5 引物設計及合成 通過NCBI 上的Primer-BLAST設計引物（表2），送至北京華大科技有限公司合成。

1.6 qRT-PCR 將反轉錄后的cDNA 稀釋為100 ng/μL，以稀釋后的cDNA 為模板進行實時熒光定量PCR，反應體系和條件：TB Green Premix Ex Taq II（2×）5 μL、PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL、DNA 模板 1 μL，滅菌水補足至10 μL；預變性95℃ 2 min，PCR 反應95℃ 30 s、65℃ 34 s 共40 個循環。每組3 個動物樣本，每個樣本重復3 次。

1.7 統計分析 利用2-ΔΔCT算法分析實時熒光定量PCR結果。運用SPSS 21.0 軟件中獨立樣本T 檢驗進行方差分析。P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。運用GraphPad Prism 8 制作柱狀圖。

1.8 綿羊ATF3基因啟動子區調控元件的分析 從NCBI上下載綿羊ATF3基因啟動子區序列，運用Genomatix 軟件中的Matlnspector 分析其調控元件及相應的轉錄因子。

表1 分析綿羊ATF3 蛋白結構特征的生物信息學網站和軟件

表2 內參和目的基因引物序列

2 結果與分析

2.1 綿羊ATF3 的生物信息學分析結果

2.1.1 綿羊ATF3 蛋白理化性質分析結果 運用ProtParam在線網站對綿羊ATF3 蛋白理化性質進行分析，結果顯示該蛋白氨基酸殘基數為187，分子質量為21 303.58，分子式為C920H1521N273O282S12，原子總數為3 008，理論等電點為8.89。帶負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）總數為26，帶正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）總數為31。不穩定系數是71.73，把該蛋白歸為不穩定蛋白。脂肪系數為78.77，總平均疏水性值為-0.630。

2.1.2 綿羊ATF3 蛋白亞細胞定位和結構預測結果 運用PredictProtein 在線網站分析綿羊ATF3 蛋白的亞細胞定位，可以看出綿羊ATF3 蛋白定位于細胞核，說明該蛋白主要在細胞核行使功能（圖1A）。運用SOPMA 在線網站預測綿羊ATF3 蛋白二級結構，結果顯示α螺旋有100 個，占53.48%；β折疊有15 個，占8.02%；β轉角有11 個，占5.88%；無規則卷曲有61 個，占32.62%（圖1B）。運用SWISS-MODEL 在線網站預測綿羊ATF3 蛋白的三級結構，結果顯示該蛋白三級結構α螺旋和無規則卷曲居多（圖1C），與二級結構預測結果相一致。

圖1 綿羊ATF3 蛋白亞細胞定位和結構預測

2.1.3 綿羊ATF3 蛋白三級結構的評估結果 運用SAVES 在線網站評估綿羊ATF3 蛋白的三級結構，結果顯示殘基在[A,B,L]區域占比100%，在[a,b,l,p]區域、[～a,～b,～l,～p]區域和無標記區域（不允許圓點出現的區域）都為0（圖2）。通常評估的判定標準是[A,B,L]區域達到90% 以上便認為三級結構的預測質量較高，可見本實驗預測的綿羊ATF3 蛋白三級結構質量良好。

圖2 綿羊ATF3 三級結構的拉式構象圖

2.1.4 綿羊ATF3 蛋白疏水性和磷酸化位點分析結果運用ProtScale 在線網站分析綿羊ATF3 蛋白的疏水性（圖3A），結果顯示在第24 位氨基酸（Ala）處分值最大，為1.756，表明該區域為高疏水性區域；在第97和98 位氨基酸（Arg 和Arg）處分值最小，為-4.144，該區域為高親水性區域。運用KinasePhos 在線網站分析綿羊ATF3 的磷酸化位點，結果顯示該蛋白存在3 個絲氨酸位點和2 個蘇氨酸位點（圖3B）。

圖3 綿羊ATF3 蛋白疏水性（A）和磷酸化位點（B）分析

2.1.5 綿羊ATF3 氨基酸序列同源性及系統進化樹分析結果 運用DNAStar 軟件分析綿羊ATF3 氨基酸序列的同源性及系統進化樹，結果顯示，綿羊ATF3 氨基酸序列與山羊（XP_017916237.1）、牛（XP_010811857.1）、豬（XP_020919512.1）、兔（XP_008266664.1）、獼猴（NP_001252939.1）、人（NP_001025458.1）、大鼠（NP_037044.1）、小鼠（NP_031524.2）、雞（XP_015139364.1）、斑馬魚（NP_957258.1）相應序列之間的同源性分別為100%、98.4%、99.5%、97.8%、97.8%、97.3%、96.2%、96.2%、86.3%、72.9%（圖4A）。進化樹顯示綿羊ATF3與牛、山羊、豬處于同一分支（圖4B），表明其親緣關系相近。

圖4 綿羊ATF3 氨基酸序列同源性（A）及系統進化樹（B）分析

2.2 熒光定量分析結果 對正常組和禁食組綿羊肌肉ATF3mRNA 的表達進行實時熒光定量檢測，結果顯示相對于正常組，禁食組ATF3mRNA 表達量極顯著降低了92.33%（圖5）。

圖5 正常組和禁食組綿羊肌肉ATF3mRNA 表達水平

2.3 綿羊ATF3啟動子區調控元件的分析 Matlnspector分析綿羊ATF3基因啟動子區，結果顯示綿羊ATF3基因2 kb 啟動子區存在許多調控元件，其中包括與應激相關的多種元件，如CREB、NFKB、AP1 和GRE 等（表3）。

3 討 論

本研究分析表明，綿羊ATF3 蛋白的不穩定系數是71.73，歸為不穩定蛋白，這為進一步研究中構建重組載體時需要通過融合特定標簽或替換特定氨基酸等措施來增加ATF3 的穩定性提供了啟示。亞細胞定位結果顯示綿羊ATF3 蛋白位于細胞核，符合ATF3 作為轉錄因子的功能特點。大部分核定位信號的共同特征是含有起關鍵作用的堿性氨基酸，例如Lys-和Arg-[17]，而綿羊ATF3 氨基酸序列第94～99 位（RKKRRR）剛好富含Lys-（縮寫K）和Arg-（縮寫R），所以推測綿羊ATF3 蛋白定位于細胞核可能與其具有核定位信號有關。綿羊ATF3 氨基酸序列與山羊、牛、豬、兔、獼猴、人、大鼠和小鼠相應序列之間的同源性均超過95%，說明ATF3基因編碼序列在不同物種間具有較高的保守性和一定的變異性，這為進一步通過比較不同物種間ATF3的功能和結構差異來鑒定發揮特異性作用的氨基酸位點提供了部分依據。

ATF3 在應激刺激下形成二聚體激活或抑制靶基因表達，可調節動脈粥樣硬化形成、葡萄糖穩態和腫瘤發生等代謝或與代謝相關的過程[5,18]。高密度脂蛋白具有抗動脈粥樣硬化的作用，可誘導ATF3 的表達[19]。ATF3在肝臟中的表達可以通過抑制糖異生導致葡萄糖穩態缺陷[20]。低葡萄糖可以誘導胰島α細胞和β細胞ATF3基因的表達，而上調的ATF3能提高胰高血糖素的轉錄，但不能提高胰島素的轉錄[21]。然而，本研究中，禁食組綿羊ATF3mRNA 表達量極顯著降低，與上述ATF3調節糖代謝的作用模式似乎并不一致，這可能與反芻動物特有的糖代謝機制有關，確切原因需要進一步深入研究。

表3 綿羊ATF3 啟動子區調控元件和位點分析

啟動子區轉錄因子結合元件的分析可以為研究ATF3基因的轉錄調控機制提供依據。Liang 等[22]和Hai[23]對人ATF3 5'端啟動子區域的序列分析顯示有大量的轉錄因子結合位點，如AP-1、ATF/CRE、NF-KB。對綿羊ATF3基因啟動子區的分析也發現了許多調控元件，其中部分元件如CREB、NFKB、AP1 和GRE 等及其相應的轉錄因子在其他物種的一些研究中被證明與應激有關。在應激條件下，大鼠海馬神經元中CREB 的磷酸化水平發生變化[24]。在LPS、poly I:C、CpG-DNA、PGN 或不同濃度嗜水氣單胞菌處理的各種刺激下，日本鰻魚肝臟細胞IKKα表達顯著增強，而IKKα表達又可顯著誘導NF-KB 和AP-1 表達上調[25]。Xu 等[26]研究表明，PM2.5 暴露可誘導人血管內皮細胞中AP-1 及其組分c-Jun 和ATF2 的激活。糖皮質激素（GCs）參與調節許多生理過程，如炎癥、代謝和應激反應，主要通過與其同源受體GR 結合，之后GC-GR 再結合于靶基因的GRE 或nGRE 元件，發揮正向或負向調節作用[27]。哺乳動物和斑馬魚等多種生物已被證實在應激條件下會分泌GCs，通過GC-GR-GRE 途徑來調控靶基因轉錄[28-29]。由此可以推測，CREB、NFKB、AP1 和GRE 等元件與相應轉錄因子的結合可能是介導綿羊營養剝奪后骨骼肌ATF3表達下調的部分原因。這一復雜的調控機制亟待進一步深入系統地研究證實。

4 結 論

本研究通過生物信息學軟件對綿羊ATF3基因的分子特性及啟動子區轉錄調控元件進行了分析預測，且通過定量PCR 檢測發現禁食條件下綿羊ATF3mRNA 的表達顯著下降，為進一步深入研究ATF3基因的表達調控及作用機制奠定了基礎。