綿羊TPT1 基因CDS 區遺傳結構及組織表達研究

劉旭瑩，喬利英，劉建華，楊凱捷，趙弼時，王 鳳，劉文忠

（山西農業大學動物科學學院，山西太谷 030801）

綿羊肉質細嫩，蛋白質含量高，膽固醇含量低，富含人體必需的各種氨基酸、維生素、礦物質元素等，廣受消費者喜歡。脂肪作為維持機體能量代謝平衡的重要組織，可儲存機體攝入的過多能量，在能量攝入不足時為機體提供能量儲備，但過多的脂肪組織沉積會影響家畜的胴體品質。因此探究脂肪代謝調控關鍵因子顯得尤為重要。

腫瘤蛋白翻譯控制1（Tumor Protein，Translationally-Controlled 1，TPT1）又稱翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP）、組胺釋放因子（HRF）、P21、P23，TPT1 在小鼠肉瘤細胞中首次發現[1]，參與細胞增殖[2]、遷徙[3]、凋亡[4-5]等過程。TPT1 蛋白包含1 個β-折疊，1 個H2-H3 螺旋以及1 個柔性環狀結構域[6]，可以單體蛋白質形式在細胞內發揮作用[7]，也可以二聚體形式作為分泌因子發揮免疫功能[6]。近年來，不少研究表明，TPT1基因參與糖和脂質代謝過程。例如，在豬的前體脂肪細胞增殖分化研究中發現，TPT1基因表達趨勢先升后降，抑制TPT1基因表達能引起脂肪分化標志基因表達量升高，促進豬前體脂肪細胞的分化[8]。葡萄糖可誘導TPT1表達量上升并部分轉位至線粒體與細胞核[9]。另外，高脂可通過CD36-Fyn-LKB1-AMPK 信號通路使胰島β細胞中TPT1基因表達水平下降，進而導致β細胞凋亡[10]。研究證實，在人的肝細胞中敲除TPT1基因，肝細胞再生發生障礙，脂質代謝異常[11]。BMP2 介導的間充質干細胞分化為脂肪細胞的過程中，下調TPT1基因表達可抑制脂肪細胞的形成[12]。綜上所述，TPT1基因參與糖與脂質代謝過程。因此，克隆綿羊TPT1基因，研究TPT1基因表達與脂質代謝之間的關系，可為改善羊肉品質提供理論依據。

近幾年對TPT1基因的研究焦點主要集中在癌細胞上，在家畜中的研究鮮有報道。本課題組前期測序結果表明，TPT1基因在不同品種的綿羊脂肪細胞中表達差異顯著[13]。基于上述研究，本實驗隨機挑選4 頭12 月齡的小尾寒羊，提取組織RNA，克隆TPT1基因完整的編碼區（Coding Sequence，CDS），采用生物信息分析軟件對克隆序列進行生物信息學分析，用實時熒光定量PCR 方法檢測該基因在心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織中的表達水平，為深入了解脂肪發育機制提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 在屠宰場中隨機挑選4 頭12 月齡的小尾寒羊，屠宰過程中收集心、肝、脾、肺、腎、脂肪和肌肉組織，分裝于2 mL 的凍存管并快速置于液氮中帶回實驗室，-80℃保存備用。

1.2 主要試劑 RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）和pMD18-T 載體均 購自日 本TaKaRa 公司；氯仿、異丙醇和無水乙醇均購自天津宇博精細化工；50×TAE 和瓊脂糖均購自北京索萊寶公司；2×Taq Master Mix、限制性內切酶EcoiI和BamH I購自北京百萊博科技有限公司；T4 連接酶購自南京諾維贊生物科技有限公司；DNA 膠回收純化試劑盒購自美國Omega 公司。

1.3 組織RNA 提取 Trizol 法提取心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織總RNA；用紫外分光光度計檢測所提取的RNA 濃度和OD260nm/OD280nm值。

1.4 引物設計與合成 根據NCBI 上提供的綿羊TPT1基因序列（XM_015098053.2），利用Primer Primier 5.0進行引物設計，并送至Thermo Fisher 公司進行引物合成，引物序列如表1 所示。

1.5 cDNA 的制備 反轉錄體系為10 μL：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL；RNA 500 ng，然后用RNase-free H2O補足至10 μL。反轉錄程序：37℃ 15 min；85℃ 5 s。反應完畢，收集產物置于4℃保存備用。

表1 引物信息

1.6 綿羊TPT1基因的克隆及測序 用已提取出的RNA和合成引物進行反轉錄和PCR 擴增，擴增出TPT1基因CDS 區，經瓊脂糖凝膠電泳后，對鑒定正確的PCR產物切膠，根據DNA 膠回收純化試劑盒說明書對目的片段進行純化回收。將pMD18-T 載體與回收純化的目的基因片段按照載體連接說明書操作要求充分混勻后密封，在PCR 儀中16℃連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，12～16 h 后觀察平板菌落，篩選單個的陽性克隆菌落至液體培養基中，過夜搖菌并送至Thermo Fisher 公司進行測序。

1.7TPT1基因的生物信息學分析 利用DNAMAN 軟件分析TPT1基因的核苷酸序列；利用DNAstar 軟件將測序結果與人（NM_001286272.1）、小鼠（NM_009429.3）、大鼠（NM_053867.1）、牛（NM_001014388.1）、豬（NM_214373.1）、山羊（XM_018056766.1）、兔子（NM_001082129.2）這些物 種TPT1基 因mRNA 序列進行同源性比對，并用Mega7.0 構建系統進化樹；利用DNAstar 將測序結果翻譯為氨基酸序列；利用ProtParam Tool（https://web.expasy.org/protparam/）對TPT1 蛋白質理化性質和蛋白質亞細胞結構進行分析；利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）對TPT1蛋白親疏水性進行分析；利用Net Phos3.0 Sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）軟件對TPT1 蛋白進行磷酸化分析；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）軟件預測TPT1 的蛋白質二級結構；利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）構建TPT1 蛋白質三級結構模型。

1.8 實時熒光定量PCR 以綿羊各個組織的cDNA 為模板進行熒光定量PCR 反應，反應體系為20 μL：TB Green Premix Ex Taq II 添加量為10 μL，ddH2O 6.4 μL，上、下游引 物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA 2 μL。反應程序為：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃20 s，設置43 個循環，95℃ 5 s，65℃ 1 min，升溫速率5℃/s，從65℃遞增到97℃，反應至40℃結束。

1.9 統計分析 采用2-ΔΔCt方法收集實時熒光定量數據進行分析；采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統計學分析，數據以平均數± 標準誤表示，P＜0.05 為顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1TPT1基因的擴增 以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，結果見圖1，可見一條約為660 bp 的條帶，與理論擴增目的條帶長度一致。

2.2TPT1基因的核苷酸序列分析 利用DNAMAN 對測序結果進行分析，結果顯示，TPT1基因CDS 區長660 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，A、T、C、G 堿基占比分別為27.0%、25.2%、26.2%、21.7%，AT 含量大于GC 含量。與NCBI 上的綿羊TPT1CDS 區進行序列比對發現，擴增的TPT1基因在185、555 位發生了堿基替換（T →C，A →T）。

圖1 TPT1 基因PCR 擴增產物電泳圖

2.3TPT1基因同源性與系統進化樹構建 如圖2 所示，綿羊TPT1基因與山羊的同源性最高，同源性為99.7%；與牛的同源性較高，為99.3%；與豬、兔子、小鼠、大鼠、人的同源性分別是92.3%、91.1%、88.4%、88.3%、92.9%；與哺乳動物的同源性均在88%以上。

圖2 不同物種間TPT1mRNA 序列同源性比對

由圖3 可知，綿羊與山羊遺傳距離最近，牛次之，與人遺傳距離最遠，與物種親緣關系相一致。

圖3 不同物種TPT1mRNA 序列進化樹遺傳距離關系

2.4 TPT1 蛋白理化性質分析 DNAstar 軟件分析結果表明，TPT1基因CDS 區編碼219 個氨基酸，分子式為C1091H1735N297O327S14，蛋白質分子質量為24 693.41 ku；其中29 個帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys），32 個帶負電荷的氨基酸（Asp+Glu）；pI 為5.89，不穩定系數為43.14，屬于不穩定蛋白質；總平均親水性為-0.374。

2.5 TPT1 蛋白亞細胞定位分析 Target P 軟件分析結果表明，TPT1 蛋白極有可能含有線粒體靶向肽，存在分泌信號肽的可能性較小。PSORT Ⅱ軟件分析結果表明，TPT1 蛋白質定位于線粒體、細胞核、過氧化物酶體以及細胞質的占比分別為78.3%、13%、4.3% 和4.3%。這說明TPT1 蛋白可能作為一種線粒體蛋白發揮作用，在分泌途徑中發揮作用較少。

2.6 TPT1 蛋白的親疏水性和磷酸化分析 Protscale 軟件分析結果如圖4 所示，可以看出，TPT1 蛋白所包含的疏水性氨基酸比親水性氨基酸少，說明該蛋白是親水性蛋白。Net Phos3.1 軟件分析結果見圖5，TPT1 蛋白共有16 個磷酸化位點，10 個絲氨酸位點，2 個蘇氨酸位點和4 個絡氨酸位點，這說明TPT1 蛋白可能通過不同位點氨基酸的磷酸化發揮不同的功能。

圖4 TPT1 蛋白親疏水性分析

圖5 TPT1 蛋白磷酸化位點

2.7 TPT1 蛋白二級結構和三級結構預測 如圖6 所示，TPT1 蛋白二級結構的主要形式為α-螺旋（36.07%）、β-轉角（7.76%）、無規則卷曲（37.44%）和延伸鏈（18.72%）。TPT1 蛋白三級結構的構建采用SWISS-MODEL，結果見圖7。

圖6 TPT1 蛋白二級結構預測

圖7 TPT1 蛋白三級結構預測

2.8 實時熒光定量PCR 結果分析 如圖8 所示，TPT1基因在腎臟表達量最高，心、脾表達量最低；以腎臟組織為對照，TPT1基因在各個組織中表達量有著顯著差異，肺和脂肪表達量差異不顯著，心和脾之間差異不顯著。

圖8 TPT1 基因在小尾寒羊各組織間的表達情況

3 討 論

TPT1基因是一種在進化上高度保守的基因，在細胞中發揮抗凋亡作用[4-5,14]。由生物信息學分析結果可知，小尾寒羊TPT1基因的完整編碼序列與哺乳動物的同源性均在88% 以上，符合生物進化特征。蛋白質二級結構預測顯示，TPT1 蛋白含無規則卷曲與α-螺旋較多，這與豬的TPT1 蛋白預測結果相一致[8]。另外，TPT1 蛋白是一種不穩定的親水性蛋白，大都在線粒體中發揮功能，這與前人對該蛋白的亞細胞定位研究存在差異[15-16]。研究表明，在HeLa 細胞中，TPT1 蛋白主要定位在細胞核中，但其蛋白序列中并無明顯的核定位序列[15]；在心肌細胞中，TPT1 蛋白主要定位于細胞核、線粒體、細胞質中[16]；這提示TPT1 蛋白可能通過翻譯后修飾來調控其在細胞器中的位置。另外，TPT1 蛋白可作為組胺釋放因子在免疫應答過程中發揮作用，這與本次預測結果有偏差，推測可能是因為發揮此功能時單體TPT1 蛋白形成二聚體所致[6,17]。

眾所周知，當細胞增殖結束進入末端分化時，一些分化調控基因的表達開始上調，細胞增殖相關因子表達量下調，隨后細胞周期永久性退出，因而細胞增殖相關因子可作為負調控因子調控前體脂肪細胞的分化。研究證實，miR-1236-3p 靶向TPT1基因可抑制細胞增殖[18]，這說明TPT1基因參與調控細胞增殖過程。另外，TPT1基因參與上皮間質轉化過程，提示其參與細胞干性的維持[3]，這說明TPT1基因可能在前體脂肪細胞分化過程中起著負調控作用。研究表明，經胰島素處理后的293T 細胞中，TPT1 蛋白的磷酸化位點發生了變化[19]，而胰島素參與調控細胞內的糖脂代謝過程，這說明TPT1 蛋白磷酸化位點的變化參與細胞內的糖脂代謝。另外，在外界葡萄糖的刺激下，細胞質中的TPT1 蛋白可向細胞核中轉移，說明TPT1 蛋白在糖脂代謝中可能是通過核質間的位置轉變來發揮功能[9]。

本實驗結果顯示，TPT1基因在綿羊心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織中均有不同程度表達，其中，在腎中表達量最高，其次是肌肉、肝和脂肪，在心和脾中表達量最低。在人[15]與豬[8]的研究中發現，TPT1基因在腎、肌肉、肝、脂肪中表達量較高，這與本實驗結果相一致，反映出TPT1基因在不同組織中均有表達，且在不同組織中發揮著不同的作用。

4 結 論

本研究采用PCR 方法克隆了小尾寒羊TPT1基因的完整編碼序列，生物信息學分析表明，TPT1 蛋白屬于不穩定水溶性蛋白，在線粒體、細胞核、細胞質中發揮作用。實時熒光定量PCR 結果表明，在不同組織中TPT1基因均有表達。本實驗為揭示TPT1基因在前體脂肪細胞分化過程中的調控提供一定基礎數據。