不同羽色鴿種MC1R 基因的擴增與序列分析

張 蕊 ，湯青萍，穆春宇，楊明軍，夏愛萍，付勝勇，常玲玲，卜 柱*

（1.江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚州 225125；2.河南天成鴿業(yè)有限公司，河南舞鋼 462513）

羽色是禽類重要的外貌特征，可用于品種純度的評價以及個體的雌雄鑒別，也可用于標(biāo)記品種特征，輔助保護禽類遺傳資源并指導(dǎo)育種。禽類羽色是由多基因控制的性狀，其遺傳機制復(fù)雜，基因間存在顯隱性、互作、上位等關(guān)系，至今已發(fā)現(xiàn)多個基因座與色素形成有關(guān)，包括多種酶、結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等[1]，其中一個重要的基因座是擴展位點E（Extension），該基因座影響真黑素和褐黑素的相對分布，其對應(yīng)的編碼基因為黑素皮質(zhì)素受體1（Melanocortin-1 Receptor，MC1R）基因[2]。MC1R 為7 跨膜結(jié)構(gòu)G 蛋白耦聯(lián)受體，在黑色素細(xì)胞中起著重要作用，可以調(diào)控真黑素（包括棕色素和黑色素）的生成。MC1R基因只有1 個外顯子，其多態(tài)性會引起氨基酸組成改變，使MC1R 的構(gòu)象和功能發(fā)生改變，繼而影響相應(yīng)的調(diào)控因子，導(dǎo)致色素沉積表現(xiàn)為偏黑、偏褐或者偏白，最終造成羽色的差異[3]。

太湖鴿（暫定名）原產(chǎn)地為江蘇省中南部，中心產(chǎn)區(qū)為環(huán)太湖地區(qū)。太湖鴿體型中等，全身大面積為白色，頭頂一點黑色（或棕色），尾羽黑色（或棕色）蓋過肛門，黑（棕）白兩色之間界限整齊，大部分為鳳頭，少量平頭，部分個體存在多趾性狀，其毛色、鳳頭外觀奇特，具有典型的特征。目前對于雞、鴨、鵪鶉等禽類的羽色及其對應(yīng)的基因座已有廣泛而深入的研究，而鴿子羽色遺傳機制研究還處于起步階段。本實驗以太湖鴿為實驗組，以烏鴿（全身黑羽）和白卡奴鴿（全身白羽）為對照組，對其MC1R基因進行PCR 擴增，檢測不同羽色鴿種MC1R基因的差異，為太湖鴿遺傳資源的保護和品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗所用太湖鴿、烏鴿和白卡奴鴿均來自江蘇威特凱鴿業(yè)有限公司。如圖1 所示，太湖鴿全身大部分白羽，僅頭頂和尾部為黑羽或棕羽，烏鴿為全身黑羽，黑色深淺程度存在差異，白卡奴鴿為全身白羽，沒有其他顏色羽毛，采集3 個品種鴿血樣各10 個，肝素鈉抗凝，使用DNA 提取試劑盒進行血液基因組DNA提取，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI 上鴿MC1R基因（登錄號：XM_013367785.2）的序列信息，使用Primer 3 軟件（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/）在線設(shè)計1 對引物，引物信息：F：5'-GTGCCCTGGAGCTGAG GT-3'，R：5'-CCATTATCGGTGTCCCACTG-3'，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

圖1 烏鴿、白卡奴鴿和太湖鴿（黑、棕）

1.3 PCR 擴 增 PCR 擴增總 體系為25 μL：12.5 μL 2×Taq PCR premix（天根生物有限公司），上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，9.5 μL ddH2O，2 μL 模板DNA。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72℃終延伸8 min；10℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將相同鴿種的不同個體進行混樣，送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行測序。

1.4 序列分析 利用在線BLAST 軟件進行序列同源性分析，用DNAMAN 預(yù)測該基因的開放閱讀框（Open Reading Frame,ORF），利用EXPASY 網(wǎng)站相關(guān)軟件分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、分子量、等電點、跨膜區(qū)域等；使用Jalview 軟件進行相關(guān)氨基酸序列比對；使用MEGA 5.1 軟件進行進化樹構(gòu)建；使用SignaIP 4.1 在線預(yù)測信號肽；使用HNN 在線預(yù)測其氨基酸二級結(jié)構(gòu)；使用SWISS-MODEL 在線預(yù)測其蛋白3D 結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 鴿MC1R基因的PCR 擴增結(jié)果 由于MC1R基因僅有1 個外顯子，本研究設(shè)計1 對涵蓋整個外顯子的引物進行PCR 擴增，擴增片段長度為988 bp，分別以太湖鴿、白卡奴鴿和烏鴿血液基因組DNA 為模板，經(jīng)PCR 擴增獲得與預(yù)期大小一致的目的片段及少許雜帶（圖2），送生物公司經(jīng)切膠回收后測序，得單一峰圖結(jié)果。

圖2 鴿MC1R 基因PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 鴿MC1R基因同源性分析 對測序結(jié)果進行分析，獲得942 bp 鴿MC1R基因完整編碼區(qū)（Coding Sequence,CDS），共編碼313 個氨基酸，分子量為35 659.63，等電點為8.78。進行序列比對分析發(fā)現(xiàn)，該序列與雞、珠雞、日本鵪鶉等同源性均達(dá)到90% 以上。根據(jù)本實驗獲得的太湖鴿（Taihu Pigeon）、白卡奴鴿（Carnean Pigeon）和烏鴿（Wu Pigeon）序列，利用MEGA 軟件使用Neighbour-joining 法將本實驗所得序列與GenBank上發(fā)表的雞（Gallus gallus）、日本鵪鶉（Coturnix japonica）、火雞（Meleagris gallopavo）、珠雞（Numida meleagris）、綠頭鴨（Anas platyrhynchos）、天鵝（Cygnus cygnus）、人（Homo sapiens）、豬（Sus scrofa）、鼠（Mus musculus）、水牛（Bubalus bubalis）等物種的MC1R基因mRNA 序列進行聚類分析，結(jié)果顯示本實驗獲得的3 個鴿種單獨聚為一類，最后與綠頭鴨、雞、火雞等其他鳥類匯聚為一支，而人、豬、鼠等哺乳動物最后匯聚為一支（圖3），這些結(jié)果均表明所得序列確實是鴿的MC1R基因。

圖3 基于MC1R 基因氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹

2.3 太湖鴿MC1R 蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)分析 利用生物信息學(xué)在線軟件分析發(fā)現(xiàn)MC1R 蛋白存在7 個跨膜區(qū)域（圖4）；該蛋白為非分泌蛋白，定位于細(xì)胞膜上的概率最高；預(yù)測其蛋白3D 結(jié)構(gòu)見圖5，進一步驗證了該蛋白預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)。

圖4 太湖鴿MC1R 蛋白的跨膜區(qū)域分析

2.4MC1R基因序列及氨基酸二級結(jié)構(gòu)差異分析 測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖6），白卡奴鴿與烏鴿的MC1R基因編碼區(qū)核酸序列基本一致，且黑羽和棕羽太湖鴿的MC1R基因序列沒有差異，而太湖鴿與另外2 個鴿種分別于279 bp（A＞G）（圖6-a）和520 bp（G＞A）處存在堿基差異（圖6），其中A279G 為同義突變，G520A 造成了氨基酸（Ser174Gly）的改變。太湖鴿與另外2 個鴿種僅在第174 氨基酸處存在差異，鴿子MC1R基因與其他鳥類MC1R基因編碼區(qū)的序列長度存在差異，于第227氨基酸處缺失1 個氨基酸，于第26～31 氨基酸處存在連續(xù)氨基酸差異（圖7）。相較于烏鴿和白卡奴鴿，太湖鴿MC1R 蛋白的α螺旋結(jié)構(gòu)多一個氨基酸，而延長鏈結(jié)構(gòu)少一個氨基酸（圖8）。可見，這3 種鴿MC1R基因序列的部分堿基差異，造成對應(yīng)氨基酸的差異，從而導(dǎo)致了氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)的不同。

圖5 太湖鴿MC1R 蛋白3D 結(jié)構(gòu)模型

圖6 MC1R 基因突變位點

3 討 論

禽類羽色的差異主要是由黑色素的種類和分布不同造成的，黑色素主要有真黑素（Eumelanin）和褐黑素（Pheomelanin），是酪氨酸的衍生物，而真黑素和褐黑素的比例變化則主要由MC1R 及其拮抗劑刺鼠蛋白調(diào)控[4]。一般情況下，內(nèi)源性的α-促黑色素細(xì)胞激素（α-melanocyte Stimulating Hormone，α-MSH）結(jié)合MC1R 可以增加真黑素的生成，刺鼠信號蛋白（Agouti Signaling Protein，ASIP）與MC1R 結(jié)合則會抑制真黑素的生成，增加褐黑素（包括紅色素和黃色素）的產(chǎn)生[5]。MC1R 是G 蛋白耦聯(lián)受體家族中最小的受體，不同物種間存在著氨基酸序列長度的差異，如鴨為284 個氨基酸[6]、雞為314 個氨基酸[7]、鵪鶉為314 個氨基酸[8]、犬為317 個氨基酸[9]等。本實驗擴增獲得的3 種鴿子MC1R基因編碼區(qū)均為942 bp，共編碼313 個氨基酸，BLAST 比對結(jié)果顯示該序列與鳥類MC1R基因同源性較高，經(jīng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)該序列與鳥類MC1R基因聚為一類，經(jīng)跨膜區(qū)域分析可知該蛋白存在7 個跨膜結(jié)構(gòu)，符合7 跨膜G 蛋白耦聯(lián)受體特征，以上結(jié)果均表明所得序列為鴿子MC1R基因。由于棕色和黑色均屬于真黑素，因而本實驗獲得的棕色羽和黑色羽太湖鴿的MC1R基因編碼區(qū)沒有差異。

α-MSH 和促腎上腺皮質(zhì)激素分別是MC1R 的2 個配體，兩者與黑色素細(xì)胞膜上的MC1R 結(jié)合后，會改變G 蛋白耦聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)，激活膜上的腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，催化三磷酸腺苷（ATP）生成環(huán)磷酸腺苷（cAMP），進一步激活酪氨酸激酶，活化細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸酶，催化酪氨酸生成多巴同時多巴還能進一步被酪氨酸酶氧化為多巴醌，促使黑色或棕色真黑素合成[10-12]。當(dāng)黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶含量或活性較高時，會生成真黑色素，反之則生成褐色素。而ASIP 作為內(nèi)源性拮抗劑可以競爭性地與MC1R 結(jié)合，并阻止cAMP 的形成，抑制酪氨酸酶活性，進而抑制真黑素產(chǎn)生。若ASIP 表達(dá)低則真黑素與褐黑素比例升高，羽色產(chǎn)生黑化變異，若ASIP 表達(dá)高，則羽色產(chǎn)生白化變異[13]。MC1R基因上的突變不僅可以改變黑色素生成相關(guān)基因的表達(dá)，還可以改變MC1R上游相關(guān)基因的表達(dá)，繼而形成羽色差異。本實驗發(fā)現(xiàn)，太湖鴿與烏鴿及白卡奴鴿于G520A 造成了氨基酸（Ser174Gly）的改變，太湖鴿在該位點為GG 純合型，而烏鴿和白卡奴鴿在該位點為AA 純合型，此結(jié)果與任嘉[14]在黑、白色羽鴿子上檢測的結(jié)果一致，太湖鴿MC1R基因在此位點上的突變可能造成了相關(guān)基因表達(dá)的變化，繼而造成羽毛色素沉積的差異。MC1R基因編碼區(qū)的突變所造成的羽色差異可能因物種不同而存在差異，Zhan 等[15]研究發(fā)現(xiàn)矛隼MC1R基因編碼區(qū)的1 個單堿基突變造成了黑、白羽色差異，但其白化或黑化性狀可能還有其他位點的參與；而Bourgeois 等[16]則發(fā)現(xiàn)馬斯繡眼鳥MC1R基因上的突變未造成黑化差異。本實驗中黑色羽和白色羽鴿子的MC1R基因編碼區(qū)沒有差異，推測可能造成這2 種羽色差異的并不是來源于MC1R基因編碼區(qū)的突變，而是MC1R基因調(diào)控區(qū)或者其他基因上的突變造成[17]。

圖7 各物種MC1R 氨基酸序列比對圖

圖8 太湖鴿、白卡奴鴿和烏鴿MC1R 氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測示意圖

動物的羽毛色素沉積模式主要由色素生成細(xì)胞（生黑色素細(xì)胞）的差異性分布以及黑色素合成通路調(diào)控，Gluckman 等[18]通過對日本鵪鶉（腹部白色而背部為有色羽）胚胎不同部位的毛囊組織進行羽色相關(guān)基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，ASIP 轉(zhuǎn)錄本只在日本鵪鶉白色腹部毛囊組織中高表達(dá)而背側(cè)沒有，對MC1R 起活化作用的促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原則在所有毛囊組織中高表達(dá)，這些結(jié)果表明鵪鶉腹部白羽的表型可能由MC1R 被抑制造成，而背部有色羽的形成可能需要MC1R 激活真黑素生成。Zhang 等[19]對不同羽色日本鵪鶉的MC1R基因和ASIP基因表達(dá)量進行檢測后發(fā)現(xiàn)，日本鵪鶉的黑羽性狀可能是由MC1R基因表達(dá)的上調(diào)或者ASIP的下調(diào)造成的。本實驗中太湖鴿頭頂和尾羽黑色而其他部位羽毛白色可能與ASIP的差異性表達(dá)有關(guān)，但有待于下一步驗證。

4 結(jié) 論

本實驗獲得太湖鴿、烏鴿和白卡奴鴿MC1R基因完整CDS 序列，烏鴿與白卡奴鴿的MC1R基因CDS區(qū)不存在堿基差異，而太湖鴿與另外2 種鴿子MC1R基因存在堿基差異且造成氨基酸的改變，推測與太湖鴿的特殊羽色形成有關(guān)。