綿羊前體脂肪細胞分化過程中HOXC8 DNA甲基化的研究

趙弼時，劉建華，喬利英，劉旭瑩，王 鳳，劉文忠

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷 030801）

脂肪組織在能量代謝中具有重要作用[1]。綿羊作為世界上主要的肉類家畜資源之一，過多的白色脂肪堆積會影響其胴體品質[2]。同源框基因（Homeobox，HOX）家族編碼一類重要的發育轉錄因子。綿羊HOX基因家族有39 個成員，分屬于HOXA、HOXB、HOXC和HOXD4 個基因集群[3]。該家族的許多成員參與脂肪形成[4-5]。HOXC8作為HOX家族的一員，在調控細胞成肌[6]、成骨[7]以及成脂分化等生物過程中發揮重要作用。對成脂分化的研究表明，HOXC8抑制人脂肪源性干細胞（Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells，ADSCs）的分化和脂質沉積[8]，且在不同的脂肪組織中差異表達[9-10]。可見，HOXC8在脂質沉積中發揮著重要作用。

DNA 甲基化是一種主要的表觀遺傳修飾方式。在3T3-L1 脂肪細胞分化過程中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma，PPARγ）啟動子區去甲基化，使其表達量升高，促進脂肪細胞分化[11]。人前體脂肪細胞中瘦素（Leptin，LEP）啟動子區呈高甲基化狀態時抑制其轉錄[12]，利于脂肪細胞的分化和脂滴沉積[13]。以上研究表明，脂肪分化相關基因可通過DNA 甲基化修飾來調控脂質代謝。生物信息學預測發現HOXC8啟動子區和第1 外顯子區各存在1 個CpG 島，為研究HOXC8的DNA 甲基化在綿羊脂質代謝中的作用提供了新的切入點。本研究旨在通過闡明綿羊前體脂肪細胞分化過程中HOXC8DNA甲基化程度及其轉錄的調節機制，為深入開展綿羊脂肪代謝機理的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 將3 只15 日齡小尾寒羊屠宰后迅速去除皮毛，用無菌的剪刀、鑷子剪下0.5 cm × 0.5 cm 的皮下脂肪組織塊。用含有1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的無菌PBS 溶液沖洗2～3 遍后，將組織塊浸泡于15 mL含有雙抗的PBS 溶液的離心管中，冷藏保存帶回實驗室。

1.2 主要試劑 瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Omega 公司；LB 固體培養基和液體培養基購自北京索萊寶公司；基因組DNA 提取試劑、pMDTM19-T 載體、Trizol 試劑、各種工具酶、反轉錄試劑盒、TaKaRa EpiTaqTMHS（for bisulfite-treated DNA）試劑盒和qPCR試劑盒購自TaKaRa 公司；EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit 試劑盒購自凱杰生物技術有限公司；雙抗、胎牛血清和高糖DMEM 培養液購自Biological Industries 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CpG 島預測分析 根據NCBI GenBank 數據庫上公布的綿羊HOXC8基因序列，利用MethPrimer 軟件（http://www.uro-gene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）預測綿羊HOXC8基因序列（轉錄起始位點上游2 000 bp 和完整基因序列）的CpG 島位置，參數設置為Observed/Expected radio＞0.60，Percent C+Percent G＞50.00，Length＞200。

1.3.2 綿羊前體脂肪細胞的分離培養及誘導分化 按照參考文獻[14-16]中的方法，在嚴格無菌的環境下，使用II 型膠原酶從綿羊背部皮下脂肪組織中分離得到前體脂肪細胞。在37℃、5% CO2的條件下，用含1%雙抗和10%胎牛血清的高糖DMEM 培養液培養綿羊前體脂肪細胞，每2 天更換一次培養基。當綿羊前體脂肪細胞匯合度達到80%左右時，用誘導分化培養液（在上述培養液中添加1 μmol/L 地塞米松，1 mg/L 胰島素，0.5 mmol/L IBMX）進行誘導分化，每2 天換一次液，分別在分化第0、2、4、6、8、10、12 天收集細胞用于HOXC8時序表達的檢測和甲基化水平檢測。

1.3.3 細胞總DNA 的提取 使用DNAiso Reagent 按照說明書分別提取分化第0 天和第2 天的綿羊前體脂肪細胞中的基因組DNA。

1.3.4 細胞總RNA 的提取 使用RNAiso Plus 按照說明書提取所收集細胞的總RNA，利用紫外分光光度計檢測樣品總RNA 濃度及OD260nm/OD280nm。

1.3.5 qPCR 根據NCBI 核酸數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中公布的綿羊HOXC8基因的mRNA 序列，以β-Actin作為內參基因，設計qPCR 引物，引物序列見表1。根據反轉錄試劑盒Prime Script?RT reagent kit with gDNA Eraser 的說明書對所提取的RNA進行反轉錄獲得cDNA。以cDNA 為模板，用SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測mRNA 的表達量。反應總體系為20 μL：TB Green Premix Ex Taq II（2×）10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA 產物2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應程序：95℃預變性30 s；PCR 反應階段95℃ 15 s、60℃ 30 s，39 個循環；熔解曲線分析階段95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。

表1 HOXC8 和β-Actin mRNA 的qPCR 引物

1.3.6HOXC8CpG 島甲基化水平檢測 利用在線程序NEBuilder（http://nebuilder.neb.com/）軟件對HOXC8啟動子區和第1 外顯子區進行甲基化引物設計，引物序列見表2。先利用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit 試劑盒對基因組DNA 進行亞硫酸氫鹽轉化，然后利用TaKaRa EpiTaqTMHS （for bisulfite-treated DNA）試劑盒進行PCR 擴增，總體系為20 μL：TaKaRa EpiTaq HS 0.1 μL，EpiTaq PCR Buffer（10×）2 μL，25 mmol/LMgCl22.4 μL，dNTP Mixture 2.4 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 7.1 μL。反應程序：94℃預變性5 min；PCR 擴增94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 1 min，40 個循環；4℃保存。用2% 的瓊脂糖凝膠鑒定PCR擴增產物，用膠回收純化試劑盒回收目的片段并用紫外分光光度計檢測其濃度，將濃度高的純化產物與pMDTM19-T 載體連接，連接產物經感受態細胞DH5α轉化后涂板，培養12 h 后挑選陽性克隆，隨機挑取20個陽性克隆送華大基因測序。將甲基化引物擴增的序列和原始DNA 序列以及轉化序列比對，統計發生甲基化的CpG 島。

表2 HOXC8 甲基化水平檢測引物

1.3.7 數據分析 甲基化水平差異的顯著性檢驗通過SPSS 統計分析軟件（Version 21.0，美國）分析，結果以平均值± 標準誤表示。使用MSR（http://www.msrcall.com/MSRcalcalate.aspx）軟件分析BSP 測序結果，并用于甲基化圖譜的繪制和分析。熒光定量數據采用2-ΔΔCT法計算基 因mRNA 相對表達量。使用GraphPad Prism7（GraphPad Software，美國）軟件中的一般線性模型對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 綿羊HOXC8基因CpG 島預測 生物信息學預測發現HOXC8基因啟動子區存在1 個CpG 島，位于HOXC8基因g.-397～-105 區域（圖1A），HOXC8完整基因序列中存在1 個CpG 島，位于HOXC8基因g.+98～+518 區域（圖1B），覆蓋其第1 外顯子區。

2.2 綿羊前體脂肪細胞的培養效果與成脂能力 從綿羊皮下脂肪組織中分離出的前體脂肪細胞呈梭形，且細胞狀態良好（圖2A）。待綿羊前體脂肪細胞密度達到90% 左右，進行成脂誘導分化，10 d 后進行油紅O 染色。分離出的前體脂肪細胞經誘導可產生大量脂滴（圖2B）。結果表明從綿羊皮下脂肪組織中成功分離出前體脂肪細胞，可用于后續研究。

圖1 HOXC8 基因CpG 島預測結果

圖2 體外培養的綿羊前體脂肪細胞

2.3 綿羊HOXC8啟動子區和第1 外顯子區的BSP 結果對亞硫酸氫鹽處理后的DNA 進行PCR 擴增。HOXC8啟動子區擴增產物的長度約305 bp（圖3A）。HOXC8第1 外顯子區擴增產物的長度約357 bp（圖3B），均為單一明亮條帶，與預期產物大小一致。

圖3 BSP 處理后HOXC8 啟動子區和第1 外顯子區擴增產物

2.4HOXC8在綿羊前體脂肪細胞分化過程中的表達趨勢 如圖4 所示，HOXC8mRNA 的表達量在綿羊前體脂肪細胞分化前極顯著高于分化后；分化第6 天HOXC8mRNA 的表達量顯著高于其他5 個時間點，但與分化前相比表達水平仍極低。結果說明HOXC8可能主要在前體脂肪細胞分化前發揮作用。

2.5 綿羊HOXC8啟動子區和第1 外顯子區甲基化水平檢測 因為在綿羊前體脂肪細胞分化的第0 天和第2 天HOXC8的表達差異極顯著（圖4），故本研究選擇在分化的第0 天和第2 天檢測HOXC8啟動子區和第1 外顯子區的甲基化水平。

圖4 HOXC8 在綿羊前體脂肪細胞分化過程中的表達趨勢

HOXC8基因啟動子區包含38 個CG 位點，根據測序數據繪制成甲基化圖譜（圖5）。結果顯示分化第0 天有8 個位點發生甲基化，分化第2 天有6 個位點發生甲基化。HOXC8第1 外顯子區包含32 個CG 位點，根據測序數據繪制成甲基化圖譜（圖6）。結果顯示分化第0 天有10 個位點發生甲基化，分化第2 天僅有4個位點發生甲基化。雖然都表現為較低的甲基化水平，但在分化第0 天甲基化水平顯著高于第2 天。由圖7 可見，HOXC8基因啟動子區CG 位點的甲基化水平在分化第0 天和第2 天差異不顯著，說明綿羊前體脂肪細胞的分化不受HOXC8啟動子區甲基化的調控；比較同一分化時期HOXC8啟動子區和第1 外顯子區甲基化水平發現，第1 外顯子區甲基化水平都極顯著高于啟動子區甲基化水平（P＜0.001），說明綿羊HOXC8第1 外顯子區甲基化水平調控前體脂肪細胞的分化。

2.6 綿羊HOXC8第1 外顯子區甲基化水平與其mRNA 表達豐度的線性回歸分析 由圖8 可知，HOXC8第1 外顯子區DNA 甲基化水平與表達水平呈高度正相關（r=0.994，P＜0.000 1），說明在綿羊前體脂肪細胞分化過程中HOXC8第1 外顯子區甲基化水平正調控其mRNA 的表達。

3 討 論

圖5 HOXC8 啟動子區的DNA 甲基化圖譜

圖6 HOXC8 第1 外顯子區的DNA 甲基化圖譜

油紅O 可對細胞內的脂滴進行著色，清楚地顯示脂肪細胞形態和脂滴分布，便于分析細胞內甘油三酯沉積情況。豬背最長肌來源的肌內前體脂肪細胞在分化第8 天時用油紅O 染色形成大量脂滴[17]。本研究采用膠原酶法分離獲得的綿羊前體脂肪細胞呈梭形，誘導分化后細胞內產生大量脂滴。

圖7 HOXC8 啟動子區和第1 外顯子區的甲基化水平

圖8 HOXC8 第1 外顯子區甲基化水平和mRNA表達水平回歸分析

HOXC10在綿羊骨髓間充質干細胞成脂分化過程中mRNA 的表達量隨著時間的推移逐漸下降[18]。在誘導ADSCs 成脂分化過程中，HOXC8的表達量在脂肪形成過程中呈下降趨勢[8]。本研究也發現，HOXC8mRNA 表達量在前體脂肪細胞分化前顯著高于分化后，說明HOXC8可能主要在綿羊前體脂肪細胞分化前發揮生物學功能。

本研究中綿羊前體脂肪細胞分化過程中HOXC8mRNA 的表達不受其啟動子區甲基化的調控。在豬前體脂肪細胞分化過程中，硫氧還蛋白結合蛋白（Thioredoxin-Interacting Protein，TXNIP）啟動子區甲基化水平基本為0，且不隨表達量的升高而變化，說明TXNIP的表達可能不受其啟動子區甲基化的調控[19]，與本研究結果一致。小鼠脂肪細胞分化前HOXA5啟動子區甲基化水平顯著低于誘導分化第4 天，且與其表達量呈負相關[20]，與本研究中前體脂肪分化不受HOXC8啟動子區甲基化調控相矛盾，這可能與物種或選擇分化時間的不同有關。關于在綿羊前體脂肪細胞誘導分化2 d后HOXC8啟動子區的甲基化水平有待于進一步研究。

許多研究證實，DNA 甲基化可以抑制或沉默基因的表達[21-22]。但也有報道顯示在基因不同位置的DNA甲基化可以對基因表達產生相反的作用。在脊椎動物中，當甲基化位于基因編碼區時，不僅沒有抑制基因的表達，相反還起到促進作用[23]。人類全基因組關聯分析顯示，基因編碼區的DNA 甲基化與基因表達呈正相關[24]。本研究也發現，在綿羊前體脂肪細胞分化過程中，HOXC8第1 外顯子區甲基化水平正調控HOXC8mRNA 的轉錄。

4 結 論

本研究結果表明，HOXC8可能主要在綿羊前體脂肪細胞分化前發揮作用，在分化過程中HOXC8在轉錄水平的表達受第1 外顯子區甲基化的正調控。