RPL35A 基因在不同月齡寒泊羊肌肉組織中的表達及其生物信息學分析

賀名揚 ，劉愛菊，張 鑫，周榮艷，田樹軍，白 瑩*，陳曉勇*

（1.河北農業大學動物科技學院，河北保定 071000；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056000）

寒泊羊是以杜泊綿羊為父本、小尾寒羊為母本經過十余年培育的肉繁兼用新種群，于2014 年通過河北省畜牧獸醫局組織的中試論證，該種群繁殖性能明顯[1]，但肉用性能選育仍停留在增重等表型層面。因此，篩選、挖掘、鑒定影響肌肉組織發育的關鍵候選基因有助于解析肌肉組織發育規律，為肉質性狀遺傳機理研究和選育提供理論依據。RNA-seq 技術可從轉錄水平篩選差異表達的基因，已廣泛應用于畜禽動物的經濟性狀遺傳機理研究[2-4]。

核糖體蛋白基因（RPL35A）位于人3 號染色體的q29-qter 區段，編碼大亞基中的核糖體蛋白L35AE 家族中的RPL35A 蛋白。在小鼠中，該蛋白位于核糖體中的P 位和A 位或完全位于P 位，與啟動因子及延伸因子相結合參與核糖體的翻譯活動[5-6]。杜玉杰等[7]對大熊貓RPL35A基因及其編碼的蛋白序列研究發現，RPL35A其理化性質和功能位點在哺乳動物中高度保守，對于核糖體編碼蛋白質極其重要。此外，有研究表明RPL35A基因變異與再生障礙性貧血有關[8-11]。Pappas 等[12]研究發現60S 核糖體亞單位的L35a 和40S 核糖體亞單位的S5 表達受分化鼠類紅白血病細胞的共同機制調節，導致核糖體功能下降。目前，RPL35A基因在畜禽領域的研究報道很少。本團隊前期研究利用轉錄組測序方法篩選到RPL35A基因為不同月齡寒泊羊mRNA 差異表達基因（未發表），為此，本研究利用定量PCR 驗證轉錄組測序得到的RPL35A基因表達，并利用生物信息學分析RPL35A基因的核苷酸及蛋白質結構及其特性，為探究寒泊羊RPL35A基因與綿羊肌肉生長發育相關性提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品 隨機選取無親緣關系的1 月齡、7 月齡、13 月齡寒泊公羊各3 只。采集背最長肌3～5 g，用無菌生理鹽水沖洗，放入2 mL 冷凍管，迅速置于液氮中暫時保存，帶回實驗室后在-80℃冰箱中保存。

1.2 主要試劑與儀器 動物組織總RNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、瓊脂糖、DNA Marker 和熒光定量試劑盒均購自全式金（北京）有限公司，反轉錄試劑盒購自大連寶生物有限公司。實時PCR 儀為ABI 7300（Applied Biosystems,Foster City,CA,U.S.A.）。

1.3 引物合成 從GenBank 中下載綿羊RPL35A基因的mRNA 序列（XM_004002995.3），使用Primer 5 設計特異引物。引物：RPL35AF：5'-TACAAAGCAAAG AACAACA-3'，RPL35AR：5'-GGTACAGCATCACAC GAAT-3'，產物片段為169 bp，將甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH） 基因作 為內參。GAPDHF：5'-CACCCTCAAGATTGTCAGC-3'，GAPDHR：5'-CA GTGGTCATAAGTCCCTCC-3'，產物片段為107 bp。

1.4 組織RNA 提取及cDNA 合成 取100 mg 樣品在液氮中迅速研磨成粉末，依據Trizol 法提取各組織總RNA，測定濃度和純度，取10 μLRNA 樣品，70℃處理2 min，2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用NanoDrop 2000 分光光度計檢測RNA 濃度和純度。按照大連寶生物的PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 將合格的RNA 反轉錄為cDNA，質控合格后保存備用。

1.5 熒光定量PCR 檢測mRNA 表達豐度 以背最長肌cDNA 為模板，利用RPL35A F1/R1 特異引物擴增RPL35A基因的編碼區序列，反應體系（20 μL）：熒光染 料Mix 8 μL，ROX 3 μL，模 板1 μL （50 ng/μL），上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL，Taq 酶0.2 μL，無酶水7 μL。三步法反應程序：98℃ 3 min；98℃ 20 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34 個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 擴增反應程序：95 ℃ 5 min，95° C 10 s，60° C 30 s 和72° C 30 s，40個循環。模板的擴增階段，60～95℃，每15 s 緩慢升溫0.3℃，建立熔解曲線階段。按照熒光定量試劑盒說明書操作，將GADPH基因為內參，每個樣品設置3 個重復。

1.6 統計分析 RNA-seq 結果由FPKM 法計算，本實驗所采用的熒光定量法為相對熒光定量，按照2-△△Ct相對定量計算公式計算，二者之間計算方式不同。因此在進行比對時需將數據均一化處理，對分析得到的數據再使用SPSS 22.0 進行單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異顯著。

1.7 生物信息學分析

1.7.1 序列獲取及進化樹構建 通過NCBI 網站中Blastp 應用程序下載13 個物種的RPL35A 氨基酸序列及其核苷酸序列，使用DNAStar Lasergene 應用程序MegAlign 軟件對綿羊及獲取的12 個物種RPL35A基因的核苷酸序列及氨基酸序列進行多序列比對，分析綿羊RPL35A 與其他物種的相似性。使用MEGA 7.0 軟件基于近鄰結合（Neighbor-Joining，NJ）法（number of Bootstrap replication :1000）對綿羊及其他13 個物種RPL35A 氨基酸序列構建進化樹。

1.7.2 理化性質分析及亞細胞定位預測 利用ExPASy數據分析系統中的ProtParam 工具（http://web.expasy.org/protparam/），分析RPL35A 的分子式、分子質量、酸堿性、等電點和穩定性等理化性質。使用ProtScale工具（https://web.expasy.org/protscale/）分析RPL35A的親疏水性。利用SignalP 4.1 Severve 軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/） 分 析RPL35A有無信號肽，使用TMHMM Server v.2.0 軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 分 析RPL35A 有無跨膜區域。利用在線工具NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析RPL35A 的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸磷酸化位點。使用PSORT II 軟件（www.genscript.com/psort.）預 測RPL35A 的亞細胞定位。

1.7.3 蛋白高級結構預測 使用 Conserved Domains 在線軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）預測綿羊RPL35A 蛋白的結構域。使用SOPMA 在線預測軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/npsa_sopma.html）預測山羊RPL35A 蛋白的二級結構。利用SWISS-MODEL 在線軟件（https://swissmodel.expasy.org/）預測蛋白的三級結構。

1.7.4 預測蛋白互作網絡 利用STRING 數據庫（https://string-db.org/），將可信度值設置為0.7，控制互作蛋白的數量在10 以內，構建RPL35A 的蛋白互作網絡。

2 結果與分析

2.1 不同月齡背最長肌mRNA 表達豐度比較 由圖1 可知，1 月齡寒泊羊背最長肌RPL35A基因mRNA 高于7月齡，后者低于13 月齡，表達趨勢與轉錄組測序結果一致，說明轉錄組測序結果可靠，該基因可能與寒泊羊肌肉生長發育相關。

圖1 RPL35A 基因在不同月齡綿羊肌肉中的表達

2.2 不同物種RPL35A 序列系統發育分析以及相似性比較 由表1 可知，綿羊RPL35A基因核苷酸及氨基酸序列與山羊、牛、豬、家馬、貓的相似性較高。對綿羊及其他13 個物種RPL35A 氨基酸序列構建進化樹，結果發現綿羊與山羊、牛、豬同源性最高，聚為一支。與靈長目的人、黑猩猩、大猩猩同源性居中，與嚙齒目的鼠及魚類的斑馬魚同源性較低（圖2）。

表1 綿羊RPL35A 基因與其他物種氨基酸和核苷酸序列相似性分析

圖2 RPL35A 氨基酸序列系統發育分析NJ 樹

2.3 RPL35A 蛋白特性分析 ExPASy 在線軟件發現該蛋白分子質量為125.51 ku，分子式為C561H907N175O145S4，理論等電點PI=11.07，為堿性蛋白質。RPL35A 為親水蛋白（圖3-A），親水性總平均值（GRAVY）為-0.579。哺乳動物的網織紅細胞半衰期為30 h，且不穩定性系數是35.85，證明其屬于穩定蛋白。RPL35A 蛋白親水性最強的位點位于19 位的精氨酸，值為-2.722，29 位的賴氨酸為疏水性最強位點，值為1.067，疏水區域少于親水區域，進一步印證了親水性分析結果。信號肽預測分析可知，綿羊RPL35A 蛋白序列中不包含信號肽（圖3-B）。RPL35A 蛋白為親水性蛋白。通過TMHMM Server v.2.0 在線分析發現。該蛋白未見到跨膜信號，因此不屬于跨膜蛋白（圖4）。

圖3 RPL35A 蛋白特性分析

圖4 RPL35A 蛋白跨膜結構預測

磷酸化位點分析發現RPL35A 蛋白包含了多個可能存在的位點，其中絲氨酸（Ser）略低于酪氨酸（Tyr）和蘇氨酸（Thr）含量（圖5）。預測得分（Score）介于0.000～1.000，分值超過0.500 表示有被磷酸化的可能。

圖5 RPL35A 蛋白磷酸化位點預測

2.4 預測RPL35A 蛋白亞細胞的定位 亞細胞定位可明確蛋白質或表達產物在細胞內的具體存在部位，經PSORT II 軟件進行亞細胞定位分析可知，RPL35A 蛋白在線粒體（69.6%）、細胞核（17.4%）、細胞質（8.7%）、過氧化物酶體（4.3%）內發揮作用。

2.5 RPL35A 蛋白一級結構預測 預測綿羊RPL35A 蛋白結構域，結果表明綿羊RPL35A 蛋白屬于RPL35Ae超家族成員，有1 個保守結構域。

2.6 RPL35A 蛋白高級結構預測 使用SOPMA 在線分析軟件，對綿羊RPL35A 蛋白進行二級結構預測，結果發現該蛋白中有1.26%的α-螺旋、26.36%的延伸鏈、5.44%的β-轉角、66.95%的無規則卷曲，構成上述結構的氨基酸殘基數目分別為3、63、13、160 個，說明RPL35A 蛋白結構元件主要為無規則卷曲，β-轉角和延伸鏈也占一定比例，α-螺旋較少。在SWISS-MODEL網頁中提交綿羊RPL35A 氨基酸序列后預測蛋白質的三級結構，如圖6 所示，綿羊RPL35A 蛋白序列與Blast數據庫中的模板序列相似性高達82.22%，同時預測結果顯示GMQE 為0.57，QMEAN 為-1.90，覆蓋率為82.22%，表明該結構模型合理。

圖6 RPL35A 蛋白三級結構預測

2.7 RPL35A 蛋白互作網絡分析 由圖7 可知，RPL35A與核糖體蛋白合成具有緊密的蛋白互作聯系，網絡中的RPL11、RPL18A、RPL29 及RPS3、RPS11、RPS17、RPS19 和RPS20 蛋白彼此之間具有緊密的關聯性，表明RPL35A 與多個核糖體蛋白互作在核糖體合成中發揮重要作用。

圖7 綿羊RPL35A 蛋白互作網絡預測

3 討 論

RPL35基因是60S 核糖體亞基的重要組成成分，在蛋白質和內質網中發揮重要作用[13]。寒泊羊出生后，RPL35A基因的表達豐度隨著月齡增加以及自身生長發育的改變而改變。1 月齡為羔羊肌纖維發育的初級階段，6～7 月齡為商品肉羊育肥出欄階段，12～13 月齡是骨骼肌發育基本成熟的階段，因此本實驗選取這3 個發育階段。本研究結果顯示，RPL35A基因在1 月齡寒泊羊背最長肌的表達量達到最高，7 月齡達到最低，表達量曲線呈“U”型，熒光定量結果與RNA-seq 結果表達趨勢一致，說明轉錄組測序結果可靠，RPL35A基因與寒泊羊肌肉生長發育相關。

通過生物信息學分析發現，綿羊RPL35A基因所編碼的蛋白分子式為C561H907N175O145S4，分子質量為125.51 ku，該基因的蛋白質和核酸序列與豬[14]、牛[15]相似性高。跨膜信號分析和信號肽分析結果表明該蛋白不屬于跨膜蛋白且不包含信號肽；多肽序列分析發現有多個磷酸化位點，且主要分布在N-端的核苷酸結合結構域，此外，發現該序列主要在線粒體和細胞核中發揮作用。該蛋白分子質量和理論等電點與大熊貓RPL35A蛋白分子量為12.5355、pI 為11.63 接近[7]，可見該蛋白非常保守。RPL35A 蛋白屬于RPL35Ae 超家族成員，有1 個保守結構域，其二級結構主要是不規則卷曲，還存在一定比例的延伸鏈和β-轉角以及少量的α-螺旋，其三級結構與模板序列相似性高達99.09%。

本研究利用轉錄組測序技術和生物信息學分析方法篩選到了RPL35A基因為寒泊羊生長發育mRNA 差異表達基因，為綿羊的肌肉組織發育提供參考和研究價值。目前，有關RPL35A基因的生理功能認識還非常有限，除了與人貧血癥有關外[16]，研究表明真核生物翻譯延長因子2（eEF2）是RPL35A基因下調的信號分子，牛乳腺上皮細胞RPL35A基因與eEF2 作用調節β-酪蛋白合成，RPL35A基因是蛋氨酸調控β-酪蛋白翻譯延長和分泌的重要正調控因子[13]。此外，長鏈非編碼RNA lncNB1 通過與核糖體蛋白RPL35 相互作用促進腫瘤發生[17]。RPL35 基因是如何在核糖體中調控目標蛋白質的合成，進而影響與肌肉生長發育相關蛋白質的表達以及蛋白質互作網絡調控作用機制有待深入研究。

4 結 論

本研究通過對不同月齡背最長肌組織中RPL35A基因mRNA 差異表達分析發現，該基因對寒泊肉羊肌肉生長發育相關。綿羊RPL35A基因序列分析發現其與山羊、牛、豬的RPL35A基因核苷酸及氨基酸序列同源性較高，屬于親水性穩定蛋白，含有多個磷酸化位點，有1 個保守結構域，二級結構以無規則卷曲為主。與RPL11、RPL29、RPL18A 及RPS3、RPS11、RPS17、RPS19 和RPS20 蛋白互作，從而進一步調控不同發育階段寒泊肉羊肌肉生長發育。