兒茶素基于MEK/ERK信號通路對老年冠心病大鼠內皮功能的作用機制研究

周慧，雷玉華，張復貴，楊淑蓉，華曉芳，黃晶

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病又稱為冠心病，是一種缺血性心臟病[1-4]。近年來隨著社會的發展及人口老齡化的加重，導致冠心病的發生率逐年上升，冠心病的出現嚴重影響患者的身心健康[5]。動脈粥樣硬化是冠心病發病的主要病理基礎，作為一種復雜的炎性反應病變，其動脈內皮細胞功能障礙會促進動脈粥樣硬化的發展，進而導致冠心病的發生[6-7]。兒茶素是一種多種酚類天然非酶抗氧化劑，具有較好的保健效果[8]。現以兒茶素干預老年冠心病大鼠，探究兒茶素基于MEK/ERK信號通路對老年冠心病大鼠內皮功能的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物： SD健康大鼠50只，由華蘭生物工程股份有限公司提供，9～14(11.5±2.0)月齡；體質量230～260(245.3±11.7)g；于45%～55%濕度，常溫，12 h光照環境下喂養1周。(2)藥物、試劑：兔抗小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6抗體(Invitrogen公司)，大鼠抗小鼠Hcy抗體(BD公司)，小鼠抗大鼠TNF-α抗體(Hyclone公司)，兔抗大鼠NO、eNOS抗體(Sigma公司)，大鼠抗小鼠ET-1、ADMA抗體(Selleck公司)，小鼠抗兔MEK、ERK抗體(Dako公司)。(3)儀器設備：顯微鏡(蘇州工業園區匯光科技有限公司，型號 SZNTR) 、光探測器(德國ALPHALAS公司，型號 SPCM)、水浴箱(上海赫田科技儀器有限公司，型號 HH-501S)。

1.2 實驗方法 2020年1—11月于湖北恩施州中心醫院實驗室進行實驗。50只大鼠中隨機取10只為對照組，不做干預；其余40只大鼠建立冠心病模型：給予高脂、高甲硫氨酸飼料(由0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、2%膽固醇、10%豬油、3%甲硫氨酸、87.3%基礎飼料混合而成)連續喂養6周，間隔2周給予大鼠腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg，每日1次，連續3 d，記錄末次注射后30 min內的心電圖，如若滿足T波高聳、ST段抬高超過0.1 mV、心律不齊，則視為造模成功。建模中死亡2只，造模成功38只，隨機數字表法分為模型組10只(繼續高脂喂食)及小劑量組10只、中劑量組9只、高劑量組9只，分別給予兒茶素20、40、60 mg/kg，3組大鼠藥物均灌胃給藥，連續給藥1周。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 觀察大鼠冠狀動脈病變情況：大鼠建模成功后喂養1周，麻醉處死大鼠，取出心臟，收集心肌組織，使用生理鹽水沖洗干凈后進行常規石蠟包埋切片，首先將切片烤干，進行脫蠟處理，順序置入不同濃度酒精中各復水3 min；然后使用蘇木精染色15 min，之后進行多次清洗(最少3次)。清洗后使用鹽酸酒精分化處理30 s，再以1%伊紅染色，使用酒精進行脫水處理后進行脫蠟處理，封片后顯微鏡觀察大鼠冠狀動脈病變。

1.3.2 血清Hcy、TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測：腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠之后，打開腹腔，暴露腹主動脈，采血5 ml離心分離得血清，放置在-20℃環境下保存待用。使用散射比濁法檢測，在光探測器90°的單色光源中對樣品加入凝血激活劑，隨著樣品凝塊的發生，其散射光強度會隨之增加，當血清樣本完全凝固之后，其光照探測儀會隨之發生改變，隨后將血清樣本放置檢測器上進行處理并描繪出凝固曲線，按照凝固曲線對Hcy、TNF-α、IL-1β、IL-6水平進行評價。

1.3.3 血清NO、eNOS、ET-1、ADMA水平檢測。使用酶聯免疫吸附法檢測：設置10個標準孔，在10 μl待測樣品中加入40 μl樣本稀釋液，封板膜封板，置于37℃水浴箱溫育30 min，清洗反應板5次后拍干，每次間隔30 s，在除空白孔以外的各孔中加入酶標液50 μl，封膜溫育30 min，清洗反應板5次后拍干，每次間隔30 s，在各孔中加入顯色A液、B液各50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光環境下顯色15 min，在反應孔內加入終止液50 μl/孔以終止反應，于450 nm波長處測量每孔吸光度，檢測NO、eNOS、ET-1、ADMA水平。

1.3.4 心肌MEK、ERK蛋白表達檢測：使用Western-blot法檢測MEK、ERK表達，使用PBS緩沖液對標本進行沖洗，沖洗后對標本進行裂解30 min，裂解之后對蛋白濃度進行測定。隨后取20 μg/孔蛋白質進行電泳，加入蛋白緩沖液緩沖10 min，隨后電轉膜放置到濃度為10%牛奶中進行浸泡，在常溫下封閉孵育1 d。次日取出用TBST液進行沖洗，隨后結合二抗。1 h后進行清洗、顯色，對MEK、ERK蛋白表達進行檢測。

2 結 果

2.1 各組大鼠冠狀動脈病變特點比較 對照組大鼠冠狀動脈結構正常，內皮完整，層次較為清晰；模型組大鼠冠狀動脈出現中小分支，鏡下可見管壁增厚，內皮下可見泡沫細胞，粉染蛋白沉積，內膜斑塊較大；小劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠冠狀動脈逐漸出現好轉，血管內皮管壁減薄，內膜斑塊較小，見圖1。

2.2 各組大鼠血清Hcy、血管內膜厚度比較 與對照組比較，模型組大鼠血清Hcy、血管內膜厚度上升(P<0.05)；與模型組比較，小、中、高劑量組大鼠Hcy、血管內膜厚度依次下降(P均<0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 與對照組比較，模型組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平上升(P<0.05)；與模型組比較，小、中、高劑量組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平依次下降(P均<0.05)，見表2。

表1 各組大鼠血清Hcy、血管內膜厚度比較

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

2.4 各組大鼠血清NO、eNOS、ET-1、ADMA水平比較 與對照組比較，模型組大鼠NO、eNOS水平下降，ET-1、ADMA水平上升(P<0.05)；與模型組比較，小、中、高劑量組大鼠NO、eNOS水平依次上升,ET-1、ADMA水平依次下降 (P均<0.05)，見表3。

2.5 各組大鼠心肌MEK、ERK蛋白表達比較 與對照組比較，模型組大鼠MEK、ERK蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，小、中、高劑量組大鼠MEK、ERK蛋白表達依次下降(P均<0.05)，見表4、圖2。

表4 各組大鼠MEK、ERK蛋白表達比較

圖1 各組大鼠冠狀動脈變化特點(HE染色，×400)

表3 各組大鼠NO、eNOS、ET-1、ADMA水平比較

圖2 各組大鼠MEK、ERK蛋白表達Western blot圖

3 討 論

冠心病多發病于40歲以上成年人，是臨床常見和多發的心血管疾病之一[9-10]。大量臨床研究顯示，其血管內皮損傷及功能失調是引發心血管疾病的起始事件。血管內皮細胞協調血管舒張因子及收縮因子共同調節血管的舒張狀態[11]。茶葉中有效成分主要有多酚化合物、生物堿、多糖類等。茶多酚中主要的成分是以兒茶素為主的黃烷醇類。兒茶素在很多植物中存在，其中包括葡萄、蘋果及茶葉等[12-13]。兒茶素具有廣泛的生物活性，其高效清除自由基及抗氧化對人體的多種病癥預防和治療均有較大的作用，具有高效低毒的特點，是一種較為理想的天然藥物[14-15]。

Hcy為同型半胱氨酸，是機體內含硫氨基酸的一個重要的代謝中間產物，可能是動脈粥樣硬化等心血管疾病發病的一個獨立危險因子[16-17]。大量臨床研究顯示，Hcy與冠心病的發生發展有著密切的關聯，對其進行檢測能夠對冠心病的發生發展進行較為準確的評價。本研究發現，老年冠心病模型大鼠Hcy水平升高，對其使用兒茶素進行干預，能夠調節大鼠Hcy水平，起到較好的干預效果。

大量臨床研究顯示，冠心病的發生發展與內皮功能有著密切的關聯，NO、eNOS、ET-1、ADMA是臨床檢測內皮功能常用的因子，對其進行檢測能夠對內皮功能進行較為準確的評價[18-20]。宋昆鵬等[21]研究發現，冠心病模型大鼠血管內皮功能相關指標NO、eNOS水平下降，ET-1、ADMA水平上升，對其進行有效的干預，大鼠血管內皮有所改善。本研究發現，冠心病模型大鼠血管內皮功能相關指標NO、eNOS水平下降，ET-1、ADMA水平上升，與上述一致，對其使用兒茶素進行干預后，大鼠NO、eNOS水平上升，ET-1、ADMA水平下降，且大劑量組效果最好。說明使用兒茶素基于MEK/ERK信號通路對老年冠心病大鼠進行干預，其能夠改善老年冠心病大鼠血管內皮功能，具有較好的效果。

冠心病的發生發展與機體炎性反應有著密切的關聯，TNF-α、IL-1β、IL-6是臨床檢測炎性反應水平的常用指標，對其進行檢測能夠對機體炎性反應的發生發展進行較為準確的評價[22-23]。本研究發現，老年冠心病大鼠炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平上升，對其使用兒茶素進行干預，老年冠心病大鼠炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6下降，說明使用兒茶素基于MEK/ERK信號通路對老年冠心病大鼠進行干預，能夠抑制大鼠體內炎性因子，具有較好的效果。

ERK是MAPK家族中重要的成員之一，而MEK/ERK信號通路是多種細胞因子調控細胞凋亡和增殖的關鍵。其中ERK能夠被上游分子MEK的磷酸化激活，從而進一步調節細胞的增殖、分化及增殖[24]。大量臨床研究顯示，在心肌細胞損傷時，MEK/ERK信號通路能夠被激活，從而調節心肌細胞的生長、增殖及凋亡。本結果發現，使用兒茶素基于MEK/ERK信號通路對老年冠心病大鼠進行干預，能夠調節MEK/ERK信號通路，從而起到治療的效果。

綜上所述，使用兒茶素對老年冠心病大鼠進行干預，能夠改善大鼠血管內皮功能，調節MEK/ERK信號通路，抑制大鼠機體炎性因子，從而起到治療的效果，具有較好的臨床推廣意義。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

周慧、雷玉華：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫，進行統計學分析；張復貴、華曉芳：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核;楊淑蓉：課題設計，論文撰寫；黃晶：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改