Th細胞分化特異性轉錄因子在低體質量先天性心臟病患兒肺血流異常發病機制中的作用

金立臣，溫林林，韓喆，張雪杰，姚俊平，宋海龍，陶曙光

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是嬰幼兒常見的缺陷性疾病，對新生兒危害較為嚴重，存活率相對較低[1]。近年來，隨著我國醫療環境的改善及CHD外科技術的不斷發展進步，多數患兒經過手術治療可以得到較好的恢復，預后較好[2]。但對于低體質量嬰幼兒，由于其機體免疫力低下、相關器官發育不成熟，病情較為復雜，容易引發免疫功能失調等各種并發癥[3]。CHD患兒本身存在一定程度的免疫功能紊亂和低下，即存在一定的Th1向Th2漂移[4]。Th1和Th2之間相互平衡在機體免疫機制中起著重要的作用，而轉錄因子在T細胞向Th1、Th2亞群進行分化的過程中起著重要的調節作用[5]。而外周血淋巴細胞轉錄因子T-bet和GATA-3 mRNA分別于Th1和Th2細胞中特異性表達[6]。目前國內外對CHD患者外周血CD4+T細胞亞群的研究主要集中在代表Th1、Th2細胞的細胞因子變化上，對Th細胞分化的特異性轉錄因子檢測和研究甚少[7]。現觀察Th細胞分化特異性轉錄因子在低體質量CHD患兒肺血流異常發病機制中的作用，為其臨床診治提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2016年4月—2018年10月河北省兒童醫院心臟外科收治的低體質量先天性心臟病患兒100例的臨床資料，根據患兒肺充血情況，分為肺充血組(n=62)和肺缺血組(n=38)。肺充血組男28例，女34例，月齡0.4～12(8.75±0.69)個月；體質量2.85～8.63(5.62±1.54)kg；疾病類型：動脈導管未閉15例，房間隔缺損19例，室間隔缺損28例。肺缺血組男22例，女16例，月齡0.3～12(8.63±0.65)個月；體質量2.78～8.71(5.71±1.52)kg；疾病類型：肺動脈狹窄15例，法洛四聯癥13例,其他10例。另取同期在醫院治療的其他疾病低體質量患兒50例作為對照組，入院2周內無呼吸道感染，其中男22例，女28例，月齡0.5～12(8.87±0.62)個月；體質量2.69～8.60(5.82±1.68)kg；疾病類型：隱睪15例，鞘膜積液21例，腹股溝斜疝14例。3組患兒性別、年齡、體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審核批準，患兒家屬知情同意書并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 低體質量診斷標準:孕周26～40周,體質量640～246 0 g；所有病例均經體檢、輔助檢查及心臟彩色超聲確診為先天性心臟病；無肺、肝、腎等臟器嚴重病史；無嚴重感染、免疫性疾病史；入院時肝、腎功能均正常。排除合并有免疫缺陷者。

1.3 觀測指標與方法 患兒于入院1 d內采集肘靜脈血10 ml，加入EDTA 4 ml抗凝，通過聚蔗糖—泛影葡胺方法分離外周血單個核細胞(PBMC)，并分離血漿2 ml備用[8]。

1.3.1 PCR法測定T-bet和GATA-3 mRNA表達[9]：上述PBMC細胞總mRNA采用Trizol法提取，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以確定所提取的mRNA完整性。cDNA合成按照逆轉錄酶(Promega公司)說明書操作合成。RT-PCR檢測由ABI 7300 Real-Time PCR System(美國ABI公司)完成，PCR熱循環參數：96℃ 4 min，然后三步反應：94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進行40個循環，于每個循環的第三步即72℃ 30 s收集熒光信號，得到Ct值。用Δ Ct值進行統計分析并用RQ值比較各組的mRNA相對表達水平變化。引物設計：GATA-3上游引物5′-TCAGTTGCCTAAGTGGT-3′，下游引物5′-GCACGCTGGTAGCTCATACA-3′；T-bet上游引物5′-GGGACATGGGAGCAGAGA-3′，下游引物5′-TGGCGGGCTGATGGTTAT-3′；內參基因hGAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物5′-GAAGATGGTGATGGATTTC-3′。

1.3.2 血漿IL-4和IFN-γ水平測定：上述血漿采用酶聯免疫吸附法測定白介素4(IL-4)和γ干擾素(IFN-γ)水平，試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司，操作方法嚴格按照說明書執行。

1.3.3 Th1/Th2細胞水平檢測[10]：取上述抗凝血1 ml，按照1∶1的比例與RPMI培養基進行均勻混合，加入ionomyin 1 mg/L 和PMA 25 ng/L作為刺激原，同時將monensin 17 mg/L作為蛋白質轉運抑制劑，在5%CO2、37℃條件下培養4 h，對紅細胞進行裂解，再加入DPBS緩沖液2 ml進行1次沖洗，將上清液棄去，加入鼠抗人CD3-TC 20 μl和CD8-FITC 20 μl，在室溫條件下避光保存45 min；同時做陰性對照和空白對照，再進行1次緩沖液清洗，離心5 min，將上清液棄去。再加入40 g/L多聚甲醛500 μl，固定20 min，離心5 min，將上清液棄去。然后將0.1%皂素緩沖液2 ml進行破膜處理10 min，離心5 min，將上清液棄去。再用大鼠抗人IL-4單抗及大鼠抗人IFN-γ-PE，在室溫條件下孵育30 min，將0.1%皂素緩沖液2 ml加入其中，沖洗1次，離心5 min，將上清液棄去。最后用DPBS懸浮細胞(含20 g/L的多聚甲醛)500 μl，通過三色熒光流式細胞儀(NovoCyteTM型，貝克曼庫爾特)進行檢測。

2 結 果

2.1 3組T-bet、GATA-3 mRNA表達水平比較 與對照組比較，肺充血組和肺缺血組T-bet和GATA-3 mRNA表達均明顯降低，且肺充血組患兒降低較肺缺血組更為顯著(P<0.05)，見表1。

表1 3組患兒外周血淋巴細胞轉錄因子T-bet、GATA-3 mRNA表達水平比較拷貝/μg)

2.2 3組血漿IL-4、IFN-γ水平比較 與對照組比較，肺充血組和肺缺血組血漿IFN-γ均明顯降低，血漿IL-4明顯升高，且肺充血組患兒上述指標變化較肺缺血組更為顯著(P<0.05)，見表2。

表2 3組患兒血漿IL-4、IFN-γ水平比較

2.3 3組Th1、Th2細胞百分率及Th1/Th2比率比較 與對照組比較，肺充血組和肺缺血組Th1細胞百分率和Th1/Th2比率均明顯降低，Th2細胞百分率明顯升高，且肺充血組患兒上述指標變化較肺缺血組更為顯著(P<0.05)，見表3。

表3 3組患兒外周血淋巴細胞亞群Th1、Th2細胞百分率比較

2.4 CHD患兒T-bet、GATA-3 mRNA表達水平與血漿IL-4、IFN-γ水平的相關性分析 經Pearson相關性分析顯示，CHD患兒T-bet mRNA表達與血漿IL-4呈負相關(r/P=-0.764/0.000)，與IFN-γ水平呈正相關(r/P=1.258/0.005);GATA-3 mRNA表達與血漿IL-4呈正相關(r/P=0.513/0.015),與IFN-γ呈負相關(r/P=-0.525/0.032)。

2.5 CHD患兒T-bet、GATA-3 mRNA表達水平與外周血淋巴細胞亞群Th1、Th2細胞相關分析 經Pearson相關性分析顯示，CHD患兒T-bet mRNA表達與Th1百分率呈正相關(r/P=0.685/0.027)，與Th2百分率呈負相關(r/P=-0.985/0.002)；GATA-3 mRNA表達與Th1百分率呈負相關(r/P=-0.652/0.025)，與Th2百分率呈正相關(r/P=0.793/0.011)。

3 討 論

初始T淋巴細胞接受抗原刺激信號，在共刺激分子和共刺激信號的作用下發生活化，進而在不同條件下分化成調節型T淋巴細胞、Th17型、Th2型及Th1型效應細胞等不同亞型，執行相應的生物學功能[11]。其中Th2細胞主要分泌IL-13、IL-10、IL-6、IL-5、IL-4等細胞因子，主要對B淋巴細胞的活化和增殖進行刺激，同時誘導抗體產生，與機體體液免疫關系較為密切[12]。Th1細胞主要分泌TNF-α、IFN-γ及IL-2等細胞因子，在機體遲發性過敏反應的形成及細胞免疫過程中起著重要的作用[13]。Th1細胞和Th2細胞之間存在相互調節和制約的作用，兩者平衡失調會引發不同的免疫紊亂，與其他相關細胞因子致使先天性心臟病等免疫性疾病的發生[14]。本研究通過對各組受試者的外周血淋巴細胞分泌相應細胞因子進行測定，結果顯示，CHD患兒外周血淋巴細胞分泌IFN-γ的水平降低，分泌IL-4能力增強，間接反映了CHD患兒Th2型細胞功能亢進，Th1型細胞功能不足。

前體T細胞受到激素、黏附分子、局部微環境、抗原提呈細胞類型及抗原類型和濃度等作用，向Th1和Th2細胞分化，是機體化學信號作用于其表面特異性受體后，通過一系列信號傳導，從而誘導相應特征性細胞因子譜進行選擇性表達的一個過程[15-16]。近期研究顯示，轉錄因子GATA-3和T-bet分別與Th2細胞因子基因和IFN-γ基因的啟動子區結合，對Th2和Th1兩類細胞的發育和分化起到中心調節作用[17]。T-bet是轉錄因子T盒家族的成員之一，可特異性表達于Th1細胞，是其分化的特異性轉錄因子[18]。有研究顯示，對小鼠T-bet基因進行敲除后，小鼠可表現出類似于CHD的病理性免疫改變[19]。GATA-3是鋅指蛋白GATA家族的主要成員之一，可以誘導Th前體向Th2細胞分化，是其分化的特異性轉錄因子[20]。相關研究顯示，對小鼠GATA-3進行敲除后，由Th2細胞分化的相應細胞因子水平降低[21]。總之，T-bet對Th1細胞發育起到正調控作用，GATA-3也對Th2細胞的發育起到正調控作用，兩者對Th0向Th1/Th2的轉化進行調節[22]。另外，GATA-3和T-bet可形成一種自我激活的反饋型調節環路，針對相關特異性轉錄因子進行調節，進而形成一種動態調節型網絡[23]。本研究結果顯示，CHD患兒PBMC細胞GATA-3 mRNA表達水平明顯升高，T-bet mRNA表達水平明顯降低。相關性分析結果進一步證實，CHD患兒T-bet mRNA表達與血漿IFN-γ水平、Th1百分率呈正相關，GATA-3 mRNA表達與血漿IL-4水平、Th2百分率呈正相關。結合相應研究結果，可知GATA-3和T-bet表達平衡失調在Th前體細胞向Th1/Th2細胞分化過程中起著重要調控作用，進而影響血漿IFN-γ、IL-4細胞因子的分泌，參與CHD發病。

綜上所述，GATA-3和T-bet表達平衡失調對Th1/Th2細胞的平衡偏移具有重要的調控作用，從而影響血漿IFN-γ、IL-4水平，在CHD的發病機制中起著重要作用。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

金立臣：提出研究方向、研究思路，論文撰寫，論文審核；溫林林：分析試驗數據;韓喆：進行文獻調研與整理，論文修改；張雪杰、宋海龍：進行統計學分析，設計論文框架;姚俊平：實施研究過程，資料搜集整理；陶曙光：設計研究方案、研究流程