硝酸咪康唑陰道軟膠囊中、美藥典計(jì)數(shù)方法對(duì)比研究

李林樾，李翠，賀聰瑩，楊曉莉

(陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065)

硝酸咪康唑[1]，系一種廣譜、高效、毒副作用小的咪唑類抗真菌藥物，對(duì)大多數(shù)皮膚癬菌、酵母菌和放線菌等有良好的抗菌作用[2]，還對(duì)葡萄球菌、鏈球菌和炭疽桿菌等革蘭陽性菌有抑菌作用[3]。硝酸咪康唑陰道用軟膠囊的有效成分是硝酸咪康唑，為白色或微黃色軟膠囊，因針對(duì)皮膚真菌和酵母菌引起的瘙癢具有迅速的緩解作用而應(yīng)用普遍。各國(guó)藥典對(duì)外用制劑均要求進(jìn)行微生物限度檢查，且明確在進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)采取不同的前處理方式進(jìn)行供試液的制備，以達(dá)到分散均勻的目的[4]。本品屬于油脂類供試品，樣品的前處理比較復(fù)雜，加之本品的強(qiáng)抑菌型，該品種的微生物計(jì)數(shù)方法成為試驗(yàn)的難點(diǎn)[5]。本文根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則1105[6]和《美國(guó)藥典》41版<61>[7]微生物計(jì)數(shù)方法項(xiàng)下要求的方法適用性試驗(yàn)進(jìn)行方法驗(yàn)證比較，以求能建立更為科學(xué)、實(shí)用、簡(jiǎn)便、高效的硝酸咪康唑陰道軟膠囊微生物限度檢查方法。

1 設(shè)備與試劑、試藥

1.1 主要儀器與設(shè)備 SX-500蒸汽滅菌器；HFsafe-1200 LC生物安全柜；BS2202S型電子分析天平；LRH-250F生化培養(yǎng)箱；LRH-250F生化培養(yǎng)箱；LRH-250F生化培養(yǎng)箱；IPP260霉菌培養(yǎng)箱；VITEK2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)；Olympus CH型三目顯微鏡；PB-10 pH酸度計(jì)。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、黑曲霉(Aspergillusniger)，上述標(biāo)準(zhǔn)菌株均來自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，工作用菌株為第3代。

1.3 培養(yǎng)基及試劑 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，批號(hào)：180820)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，批號(hào)：181217)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA，批號(hào)：180108)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB，批號(hào)：180731)、pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào)：180820)均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。Modified Letheen-Broth Base(MLEB，EMD Millipore Corporation，有效期至20230910)；Fluid A(0.1%動(dòng)物組織胃蛋白酶消化物，青島賓得生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20170704)，按說明書配置，滅菌。上述所用培養(yǎng)基的適用性檢查均符合藥典要求。

1.4 樣品 樣品編號(hào)1：硝酸咪康唑陰道軟膠囊，規(guī)格：0.4 g，批號(hào)：068772，西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)；樣品編號(hào)2：硝酸咪康唑陰道軟膠囊，規(guī)格：0.4 g，批號(hào)：200303，南昌百濟(jì)制藥有限公司生產(chǎn)；樣品編號(hào)3：硝酸咪康唑陰道軟膠囊，規(guī)格：0.4 g，批號(hào)：200605，威海華新藥業(yè)集團(tuán)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌液制備 將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種于TSB中，35 ℃培養(yǎng)24 h；將白色念珠菌接種于SDB中，25 ℃培養(yǎng)3 d。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；將黑曲霉接種于SDA溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2.2 《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則1105方法進(jìn)行計(jì)數(shù)檢查適用性試驗(yàn)(以下簡(jiǎn)稱方法一) 根據(jù)以往的試驗(yàn)結(jié)果，使用《中國(guó)藥典》2020年版(四部)中規(guī)定的中和劑與沖洗液試驗(yàn)，先加入試驗(yàn)菌后沖洗，試驗(yàn)菌的回收率無法達(dá)到藥典要求，故選擇后加菌方式。

2.2.1 供試液制備 無菌取供試品4粒(約11.5 g)，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，轉(zhuǎn)移至無菌均質(zhì)袋內(nèi)，用均質(zhì)器拍擊1 min，膠囊殼破裂，內(nèi)容物釋放，制成1∶10供試液。

2.2.2 試驗(yàn)方法

2.2.2.1 試驗(yàn)組 取1∶10供試液10 mL加入含200 mL 1%(mL/mL)聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的輸液瓶中，混勻后薄膜過濾，用含1%(mL/mL)聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗5次，100 mL/次，在最后一次沖洗液中分別加入不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌液。取出濾膜，菌面向上，貼于TSA平板或SDA平板上，按藥典規(guī)定培養(yǎng)，計(jì)數(shù)試驗(yàn)組的菌落數(shù)。

2.2.2.2 菌液對(duì)照組 以pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨-緩沖液代替供試液，同“2.2.2.1”項(xiàng)下操作。

2.2.2.3 樣品對(duì)照組 不加金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌液，同“2.2.2.1”項(xiàng)下操作。

2.3 《美國(guó)藥典》41版<61>方法進(jìn)行計(jì)數(shù)檢查適用性試驗(yàn)(以下簡(jiǎn)稱方法二)

2.3.1 供試液制備 無菌取供試品4粒，加入120 mL已預(yù)熱的MLEB稀釋液中，均質(zhì)器拍擊1 min，膠囊殼破裂，內(nèi)容物釋放，制成1∶10供試液。

2.3.2 試驗(yàn)方法

2.3.2.1 試驗(yàn)組 取1∶10供試液9.9 mL，分別加入不大于1 000 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌液0.1 mL，混勻，全量加入已預(yù)熱的MLEB稀釋液490 mL，制成1∶500供試液。用10 mL Fluid A潤(rùn)膜后，將1∶500供試液500 mL全部薄膜過濾，每張濾膜所過濾的供試液中含菌量不大于100 cfu。用990 mL Fluid A沖洗，100 mL/次。取出濾膜，菌面向上，貼于TSA平板或SDA平板上，按藥典規(guī)定培養(yǎng)，計(jì)數(shù)試驗(yàn)組的菌落數(shù)。

2.3.2.2 菌液對(duì)照組 以MLEB稀釋液代替供試液，同“2.3.2.1”項(xiàng)下操作。

2.3.2.3 樣品對(duì)照組 不加金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌液，同“2.3.2.1”項(xiàng)下操作。

2.4 回收計(jì)算 各試驗(yàn)菌回收=(試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試液對(duì)照組菌落數(shù))/菌液組菌落數(shù)。分別計(jì)算方法一、方法二的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌回收率，若回收率在0.5～2，方法適用性試驗(yàn)通過。

3 結(jié)果

需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定各試驗(yàn)菌回收試驗(yàn)結(jié)果見表1。各試驗(yàn)菌的回收率均在0.5～2，符合藥典要求。

表1 硝酸咪康唑陰道軟膠囊微生物計(jì)數(shù)薄膜過濾法回收試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

4.1 供試液制備方法 按照“取樣量10 g”的藥典要求，本品每粒約重2.90 g，取4粒約11.5 g，基本符合藥典取樣量要求。方法一中稀釋液為100 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，這樣制得的供試液比例略大于1∶10。若調(diào)整稱樣量精確到10 g，因?yàn)檐浤z囊劑的囊殼不好處理，用滅菌剪刀等處理有造成樣品污染的風(fēng)險(xiǎn)；方法二中將4粒樣品加入120 mL稀釋液中，制得的供試液比例更接近1∶10，試驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確，操作更方便。

4.2 稀釋液預(yù)熱處理 方法一中稀釋液未預(yù)熱，拍擊后膠囊殼破碎但不溶解，供試液易沖洗過濾；方法二中稀釋液事先預(yù)熱，拍擊過程膠囊殼破碎且溶解，使得樣品中的微生物充分與稀釋液，沖洗后的濾膜上有少量膠囊殼的白色絮狀沉淀物。

4.3 加菌方式 兩種方法的加菌方式有所不同。方法一是將1∶10供試液10 mL稀釋、薄膜過濾、沖洗，在最后一次沖洗液中加入不大于100 cfu的試驗(yàn)菌；方法二是先取1∶10供試液9.9 mL加入不大于1 000 cfu的菌液0.1 mL，混勻后稀釋，再進(jìn)行薄膜過濾及沖洗，該方法更好地模擬了污染菌與樣品的混合，更加符合藥典的要求。

4.4 含中和劑的培養(yǎng)基/稀釋液的應(yīng)用 方法一中所用稀釋液為含1%(mL/mL)聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，《中國(guó)藥典》中規(guī)定的稀釋液和中和劑。聚山梨酯80對(duì)抑菌成分具有一定的中和作用，該稀釋液需要試驗(yàn)人員自己配制、滅菌；方法二中所用MLEB培養(yǎng)基有預(yù)售干粉培養(yǎng)基，未在《中國(guó)藥典》中載錄。該培養(yǎng)基含有卵磷脂0.7 g·mL-1，經(jīng)驗(yàn)證該沖洗液對(duì)試驗(yàn)菌株無抑菌性，同時(shí)有效降低藥品的抑菌成分，使試驗(yàn)操作簡(jiǎn)化。使用MELB培養(yǎng)基可應(yīng)用于具有抑菌性的藥物。

5 結(jié)語

藥品的微生物檢驗(yàn)和控制是藥品安全性保障的一項(xiàng)重要措施[8]，而供試品的處理是微生物檢驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)，是獲得較高準(zhǔn)確性和良好檢驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)[9]。《中國(guó)藥典》《美國(guó)藥典》等根據(jù)供試品的理化特性與劑型特點(diǎn)，將供試品分為水溶性供試品、水不溶性非油脂類供試品、油脂類供試品和需用特殊方法制備的供試品等類型，并給出了相應(yīng)的處理方法。然而，微生物的檢驗(yàn)結(jié)果經(jīng)常會(huì)受到藥物種類、劑型、檢驗(yàn)技術(shù)等多種因素的影響[10]，尤其是在建立抑菌型強(qiáng)且為油脂類藥品的微生物限度檢查計(jì)數(shù)方法時(shí)，常因其復(fù)雜的基質(zhì)和強(qiáng)抑菌作用而導(dǎo)致試驗(yàn)菌的回收失敗，在嚴(yán)格執(zhí)行藥典要求的基礎(chǔ)上，采用常規(guī)培養(yǎng)基、稀釋液均不能取得較好的回收結(jié)果時(shí)，可根據(jù)藥品特性，針對(duì)性地建立更方便適宜的個(gè)性化檢查方法是藥品微生物控制鼓勵(lì)的發(fā)展方向[11]。