攻下開竅方對肝性昏迷大鼠行為學的影響*

陳旭，張毅，侯文，劉家維，薛瑤瑤，范天祥

1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽712046；2.陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽712046

在臨床肝硬化患者中的發病率約占30% ～40%，是晚期肝病患者重要死因之一［1-6］。肝移植是目前治療肝性昏迷最有效的手段之一，但存在受手術后感染、宿主排斥等不良反應，目前保守治療仍是主要手段［7-9］。攻下開竅方作為多種清熱利濕藥的合劑，兼有攻下解毒、醒腦開竅之功，協同西醫保守治療肝性昏迷療效顯著［10］。故本研究采用50%的四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）聯合硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）誘導大鼠肝性昏迷模型，觀察攻下開竅方保留灌腸對肝性昏迷大鼠行為學的影響，以期為肝性昏迷的治療提供基礎實驗依據。

1 材料

1.1 動物健康雄性成年SD大鼠90只，體質量220～250 g，購自成都達碩實驗動物有限公司［合格證號：2020（陜）-002］，溫度20～25℃，濕度60%，晝夜光照時間各12 h，自由飲食飲水。所有實驗大鼠操作程序均經陜西中醫藥大學醫學倫理委員會批準實施。

1.2 藥物及試劑生大黃30 g，蒲公英30 g，石菖蒲30 g，烏梅30 g，煅牡蠣20 g，芒硝20 g，以上中藥均由陜西中醫藥大學附屬醫院中藥房統一購買，混合后制作成為每克含生藥8 g的凍干粉，備用，使用時100℃水溶解。TAA（阿拉丁，批號：T104039）；CCl4（阿拉丁，批號：C128126）。

1.3 儀器Morris水迷宮（上海移數鼠博士RD1101MWM-G）；曠場實驗箱（上海欣軟公司）；SuperMaze型高通量動物行為實驗分析軟件（上海欣軟公司）。

2 方法

2.1 分組及造模方法造模方法參考宋佰玉［11］制備肝性昏迷大鼠模型的方法。大鼠適應性飼養7 d后，用隨機數字表法將90只大鼠分為正常組、模型組、乳果糖組、攻下開竅方高劑量組、攻下開竅方中劑量組、攻下開竅方低劑量組，每組15只，除空白組外，每組大鼠按0.5 mL·100 g-1給予50%CCl4溶劑（50 mL橄欖油+50 mL CCl4）行腹腔注射，每周2次，并根據體質量變化調整劑量，共12周。在第12周后按30 mg·100 g-1給予3%TAA溶液（蒸餾水100 mL+3 g TAA）隔日行腹腔注射，隔天1次，連續2次，正常組大鼠給予等量橄欖油腹腔注射。根據大鼠肝性昏迷診斷標準，若大鼠出現嗜睡、反應遲緩，自主性活動減少、共濟失調、昏迷等癥狀之一，即可診斷肝性昏迷。

2.2 給藥方法造模成功后，按照人鼠比重，乳果糖組按6 g·kg-1的劑量給予乳果糖灌腸，攻下開竅方低、中、高劑量組分別以0.5 g·kg-1、1.0 g·kg-1、2.0 g·kg-1的劑量給予攻下開竅方灌腸，模型組及正常組給予等量蒸餾水灌腸，每日1次，連續給藥14 d。

2.3 觀察指標及評價指標

2.3.1 大鼠肝性昏迷分級若大鼠出現嗜睡、反應遲緩、自主性活動減少、共濟失調、昏迷等癥狀之一，即可診斷為肝性昏迷，分別在造模前、給藥前、給藥后參考Zimmermann氏法［12］對大鼠肝性昏迷分級進行評分。等級0：正常（11分）；等級I：嗜睡，反應遲緩，自主活動減少，反射正常（＜11分）；等級II：共濟失調，但反射仍基本正常（10～11分）；等級III：反射逐漸消失（＜10分）；等級IV：角膜反射消失，動物昏迷（0分）。

2.3.2 水迷宮實驗參考劉美琪等［13］的方法行Morris水迷宮實驗，通過水迷宮軟件系統記錄大鼠在2 min內找到平臺的逃避潛伏期，若在規定時間內未找到平臺則時間按照120 s計算。

2.3.3 曠場實驗參考Wang等［14］的方法行曠場試驗，通過計算機軟件對影像結果進行分析，得出每只大鼠5 min內運動總距離、單次最大運動距離及穿格次數。

2.4 數據分析所有數據均應用SPSS 21.0統計分析軟件進行單因素方差分析，數據以均數±標準差（±s）表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 攻下開竅方對肝性昏迷大鼠肝性昏迷分級評分的影響與模型組比較攻下開竅方低、中、高劑量組及乳果糖神經功能反射得分明顯升高，肝性昏迷分級明顯降低（P＜0.05）；與乳果糖組比較，攻下開竅方中、高劑量組得分明顯升高，肝性昏迷分級明顯降低（P＜0.05），而攻下開竅方低劑量組未見明顯統計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經反射得分與肝性昏迷分級的比較 （±s）

表1 各組大鼠神經反射得分與肝性昏迷分級的比較 （±s）

注：與模型組相比：*P＜0.05；與乳果糖組相比：＃P＜0.05

組別n 劑量 神經功能反射得分 肝性昏迷分級正常組15-11.0±0.0 0模型組15-4.1±1.3 2.9±0.5 乳果糖組15 6 g·kg-1 9.0±1.4*2.3±0.4*攻下開竅方低劑量組15 0.5 g·kg-1 7.2±1.7*2.4±0.7*攻下開竅方中劑量組15 1 g·kg-1 8.6±1.5*＃2.0±0.5*＃攻下開竅方高劑量組15 2 g·kg-1 10.7±0.3*＃1.8±0.6*＃

3.2 攻下開竅方對肝性昏迷大鼠水迷宮實驗的影響造模前，各組間無差異，說明分組均勻。造模后，與正常組比較，其余各組逃避潛伏期時間明顯延長（P＜0.05），說明造模成功。治療后，與模型組比較，攻下開竅方低、中、高劑量組及乳果糖組逃避潛伏期時間明顯縮短（P＜0.05）；與乳果糖組比較，攻下開竅方高、中劑量組逃避潛伏期變化有統計學差異（P＜0.05），而攻下開竅方低劑量組未見明顯統計學差異（P＞0.05）。見表2，圖1。

3.3 攻下開竅方對肝性昏迷大鼠曠場實驗的影響與模型組相比，攻下開竅方低、中、高劑量組及乳果糖組大鼠的運動總距離、穿格次數、單次最大運動距離均明顯增加（P＜0.05）；與乳果糖組相比，攻下開竅方中、高劑量組運動總距離、穿格次數、單次最大距離明顯增加（P＜0.05）。見表3，圖2。

表2 各組大鼠各時間節點水迷宮實驗逃避潛伏期的比較 （±s）

表2 各組大鼠各時間節點水迷宮實驗逃避潛伏期的比較 （±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05；與乳果糖組相比，＃P＜0.05

組別n 造模前 造模后 治療后正常組15 8.32±1.26 5.27±1.28*4.12±0.67*模型組15 7.96±0.67 102.23±1.42 112.63±0.91＃乳果糖組15 8.03±1.63 97.48±1.36*18.14±1.02*攻下開竅方低劑量組15 9.35±1.02 101.30±1.41*20.33±1.26*攻下開竅方中劑量組15 8.76±1.83 99.68±1.28*12.21±1.73*＃攻下開竅方高劑量組15 9.13±1.54 96.35±1.56*9.14±1.18*＃

表3 攻下開竅方對肝性昏迷大鼠曠場實驗的影響 （±s）

表3 攻下開竅方對肝性昏迷大鼠曠場實驗的影響 （±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05；與乳果糖組相比，＃P＜0.05

組別n運動總距離（l／cm）穿格次數／次單次最大運動距離（l／cm）正常組15 2391.76±549.52* 87.19±21.32*14.37±4.61*模型組15 712.51±431.68 21.84±16.75 5.72±1.69乳果糖組15 1691.36±763.59* 65.84±26.75*9.13±5.61*攻下開竅方低劑量組 15 1832.95±658.72* 62.26±30.58*8.61±2.35*攻下開竅方中劑量組 15 2239.68±521.47*＃ 83.98±21.69*＃ 13.16±1.49*＃攻下開竅方高劑量組 15 2128.59±652.18*＃ 79.41±17.55*＃ 12.78±2.56*＃

圖1 治療后各組大鼠定位航行實驗活動軌跡圖

圖2 治療后各組大鼠曠場實驗活動軌跡圖

4 討論

肝性昏迷是肝硬化晚期患者常見的機體失代償事件，其發病機制尚不明確，氨中毒學說被大多數學者所接受［15-17］。目前公認有效的藥物為乳果糖，它可以酸化腸道引起滲透性腹瀉，促進腸道乳酸菌生長，改變腸道菌群，使腸道內產氨及氨吸收進入血液循環減少［18-20］。臨床上，雖有許多西藥用于治療肝性昏迷，但尚存在不良反應。

攻下開竅方的安全性及有效性已在臨床治療中得以證明［10］。肝性昏迷屬本虛標實之病，清陽不升、濁氣不降，采用中藥灌腸的方法，通過腸黏膜吸收，繼承中醫的“攻下法”和“開竅法”之說，起到滌腸瀉毒、醒腦開竅之功。方中大黃、芒硝、蒲公英三藥合用共奏蕩滌腸毒、攻下祛邪之功，使濁氣自降、清氣自升，則神明自清［21-22］；石菖蒲開竅醒神、寧神益智；煅牡蠣滋陰潛陽、收斂固澀，防瀉下過多損傷正氣；烏梅下氣除滿、寧心合中［23］。現代藥理學研究表明，以上六藥均具有降低內毒素、抗菌抗炎、促進腸蠕動、改變腸腔滲透壓的作用［24-28］，六藥合用，可調節腸道菌群、降低內毒素的產生、使腸道產氨及吸收氨降低、改善肝功能及神經功能。此實驗證實，給藥后各組大鼠在肝性昏迷分級、逃避潛伏期、運動總距離、穿格次數、單次最大運動距離均具有統計學差異，提示攻下開竅方可增強其空間學習記憶能力及空間自主探索能力，但其機制仍需課題組后期進一步的研究。