基于生物礦化機理的自愈合混凝土制備與表征*

馮 君，陳柄丞，盧思怡，胡 瑋，許 欣，張 耀

(1. 南京理工大學 瞬態物理國家重點實驗室，南京 210094； 2. 南京理工大學 理學院，南京 210094；3. 南京理工大學 材料科學與工程學院，南京 210094)

0 引 言

混凝土具有抗壓強度高、耐久性好、價格低廉，生產工藝簡單等特點，是目前世界上使用最廣泛的建筑材料[1-3]。但混凝土的缺點是容易發生脆性破壞，從而導致強度降低[4]。這種不穩定性使得混凝土在惡劣的環境中很脆弱，尤其是暴露在有害的化學物質中，導致鋼筋的腐蝕，影響了混凝土結構的整體性和耐久性，需要巨大的維護成本。根據美國聯邦公路管理局的數據顯示，美國每年用于混凝土公路橋梁養護的直接成本為40億美元，而英國每年用于現有混凝土結構養護的成本占其建筑成本的45%[5]。

生物混凝土具有自愈能力，可以減少裂縫的形成和擴展。耐久性較好的混凝土結構，施工維護費用低得多，對于裂縫的開展和修復起著良好的影響[6-7]。通過微生物在混凝土中的礦化作用，產生碳酸鈣晶體從而填補裂縫，最重要的是與膠凝材料有良好的兼容性。生物礦化，即微生物誘導碳酸鈣沉淀(MICP)[8-9]，已被廣泛研究用來提高混凝土的耐久性。混凝土修復劑主要是由一種能夠產芽孢的枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)組成，這種細菌在惡劣的環境中通常以孢子的形式存在[10-11]，特點是低代謝活動和極長的壽命，目前已知的一些菌株能產生可存活長達200年的孢子[7]。

大多數自愈混凝土的開發研究集中在兩方面：一方面是能高效催化產生生物礦化的細菌種類，另一方面是由細菌和鈣源組成的愈合劑的固定化問題。研究發現稻殼灰(RHA)混凝土中的芽孢桿菌可以提高混凝土的耐久性[12]。球形芽孢桿菌(B.sphaericus)[13]和巴氏芽孢桿菌(Sporoscarcina pasteurii)[14]用于自愈合混凝土，裂縫寬度愈合能力約為0.3～0.5 mm。芽孢桿菌孢子的尺寸在1 μm左右，但隨著混凝土水化反應的進行，水泥凝結過程中孔徑的不斷減小，影響了細菌的生存空間，導致芽孢的壽命隨著混凝土養護時間的增加而減少[1]。因此，研究人員采用各種方法將愈合劑固定在既可以保留微生物又可以混合到混凝土基體中的載體上，枯草芽孢桿菌以輕骨料和石墨納米片為修復劑載體，能較好地修復混凝土裂縫[5]。另一種方法是將細菌溶液浸漬在輕質骨料中，并用聚合物的涂層對其進行包裹[15]，用該方法配制的自愈合混凝土具有良好的裂縫愈合效率和耐久性。

作為新型先進自愈合混凝土(Nash Conc)系列研究的一部分，本論文的重點是篩選具有良好礦化結晶性能的菌種，為后續自愈合混凝土的制備和性能表征提供依據，研制出裂縫愈合速度快、低溫強度回升顯著的新型先進自愈合混凝土。首先，對11種可利用的枯草芽孢桿菌菌株在高pH溶液中進行耐堿性測試，以獲得耐堿枯草芽孢桿菌M9。對微生物誘導碳酸鈣沉淀進行了研究，并用SEM和XRD對其進行表征。然后制備并養護自愈合混凝土梁，底部預制約為0.3 mm的裂縫并進行修復。最后，對修補后的試件進行了二次彎曲試驗和裂紋填充物物性分析。

1 枯草芽孢桿菌的篩選

在生產自愈合混凝土時，選擇合適的菌種作為愈合劑是實現碳酸鈣沉淀充填裂縫的關鍵。Hammes和Verstraete[26]總結了這一簡單化學過程的4個控制條件：(1)鈣(Ca2+)濃度，(2)溶解無機碳的濃度，(3)pH(25 ℃時pK2(CO)=10.3和(4)成核位點的可用性。對于自愈合混凝土的配制，本部分試圖通過提供成核位點和微堿性細菌環境，尋找在MICP中具有良好性能的合適菌種。

1.1 高pH溶液中枯草芽孢桿菌的篩選

為了獲得適用于高堿度基質環境的愈合劑，本工作選擇了在堿性培養基中用氫氧化鈣緩沖溶液研究其生長階段，以模擬細菌在混凝土中生存繁殖的實際情況。首先選取11株現有的枯草芽孢桿菌在LB培養基(酵母膏15.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L)中培養，并用Ca(OH)2沖液調節pH至10。在恒溫振動培養箱(HZQ-F100，華美儀，中國)中以220 r/min的轉速進行對比培養。用OD600(600 nm光密度儀)測定枯草桿菌懸浮液的吸光度，以測定其生長曲線。每隔24 h監測菌液，獲得OD600值，開始時OD600值初始化為0。如圖1所示，只有枯草芽孢桿菌M9在培養24 h后有明顯的生長，其OD值為0.42。48 h時，所有細菌培養物的OD值均增加0.2～0.3。在接下來的24 h內，只有枯草芽孢桿菌M9的OD值達到1.1，其余10株細菌的OD值保持不變。因此，在pH為10的LB培養基中，枯草芽孢桿菌M9(從奶粉中分離)生長最快，表現出最強的耐堿性。

圖1 堿性環境下11種枯草芽孢桿菌菌株的菌體濃度歷程Fig 1 Concentration history of 11 kinds of B. Subtilis in alkaline medium

1.2 枯草芽孢桿菌M9的礦化沉淀

通過對枯草芽孢桿菌M9在高pH溶液中生長曲線的評價，表明其耐堿性能最好，這是配制自愈合混凝土的基本要求。碳酸鈣沉淀能力是影響抗滲水性能的另一個關鍵因素。因此，本文進行了MICP試驗，以評價枯草芽孢桿菌M9修復混凝土裂縫的潛力。

Yang和Robbins使用放射性標記的Ca2+表明，細菌細胞中鈣的調節包括依賴于主動和被動運輸機制的流入和流出。正常的細胞內鈣濃度通常比細胞外濃度低1000倍，被動轉運通常是鈣內流的原因。另一方面，初級活性鈣轉運包括以植物類Ca2+-ATPase酶為基礎的ATP依賴的泵。這些體系以犧牲能量(ATP)為代價，以電化學梯度運輸鈣，由于質子吸收，導致pH局部增加。鈣離子濃度的增加形成了理想的局部沉淀微環境，使碳酸氫鹽平衡發生變化，進而導致體相介質pH升高。

MICP過程是利用細菌周圍培養基中溶解的CO2的新陳代謝。在給定的反應環境下，反應體系中的碳酸鹽濃度與溶解無機碳濃度和pH值有關。同時，無機碳濃度依賴于溫度、濕度和二氧化碳分壓等環境參數。在等式中(1)～(4)，二氧化碳在標準大氣壓和25 ℃下溶解于水中的平衡反應。

CO2(g)?CO2(aq)(pKH=1.468)

(1)

CO2(aq)+H2O?H2CO3(pK=2.84)

(2)

(3)

(4)

(5)

為了定量評價枯草芽孢桿菌M9的礦化沉淀能力，間接測定碳酸鈣的沉淀量，步驟如下：首先將培養皿上的枯草芽孢桿菌M9菌株小心地移至超凈臺上的液體培養基中，然后將裝有菌液的試管置于37 ℃下的振蕩培養箱中放置24 h，之后加入過量的乳酸鈣繼續搖床24 h，觀察液體中礦化反應引起的懸浮物。用離心機將礦化沉淀物從溶液中分離出來后，加入過量的鹽酸，觀察二氧化碳氣泡的產生。

收集了MICP過程中溶液形成的沉淀，并用掃描電鏡(SEM)對其進行了物相分析。將沉淀物在60 ℃的溫度下洗滌和烘干24 h，鍍膜后進行掃描電鏡觀察。圖2中的掃描電鏡測試結果表明，微生物礦化沉淀產物為方解石形狀的碳酸鈣。

圖2 微生物礦化沉淀產物的SEM照片Fig 2 SEM image of microbial-induced calcite precipitation

微生物誘導的碳酸鈣顆粒粘結在一起，這是由于細菌成核位點和官能團調控的共同作用，導致MICP過程中碳酸鹽晶體的生長較為復雜。晶體尺寸約為3 μm，呈正六面體結構，晶粒大小不均勻，有片狀或單晶狀。

采用D8 ADVANCE X射線衍射儀，Cu-kα輻射(λ=0.15418 nm)，在40 kV、40 mA條件下對礦物粉末進行了X射線物相分析。沉淀物的XRD衍射譜如圖3所示，由JADE6.0軟件的數據分析表明，MICP產生的白色沉淀是碳酸鈣。

圖3 微生物礦化沉淀產物的XRD圖譜Fig 3 XRD spectra of microbial-induced calcite precipitation

1.3 枯草芽孢桿菌M9的特性研究

為了研究枯草芽孢桿菌M9的萌發特性及生長情況，每隔4 h取細菌溶液樣品，分別用分光光度計(Biodrop duo, Shujun Instrument)和pH計(UB-7, Sartorius)測定其吸光值和pH值。

細菌溶液是以液體培養基在37℃條件下搖床獲得，測試結果如圖4所示。枯草芽孢桿菌M9在前16 h內生長迅速，24 h進入穩定期。吸光值OD600收斂于2.0左右，溶液的最終濃度約為108cfu/ml，與文獻報道的值相符[18]。通過兩曲線對比可發現，吸光值從增加到穩定這一階段與pH值變化相一致，即枯草芽孢桿菌M9的萌發生長情況與其溶液pH改變相似，最終溶液pH約為9.2，接近混凝土斷面測得的pH值(～10)。此外，弱堿性環境適合細菌誘導碳酸鈣沉淀[25]。

圖4 枯草芽孢桿菌的生長曲線及pH情況Fig 4 Growth profile and pH of Bacillus subtilis M9 stain medium

用原子力顯微鏡(AFM)觀察細菌的微觀形態。將枯草芽孢桿菌M9菌株在云母片上刮平，制得枯草芽孢桿菌M9樣品。通過Nanoscope Analysis用于數據分析，三維示意圖如圖5(a)所示。圖5(b)為枯草芽孢桿菌的垂直投影(10 μm×10 μm)，可以看出此時細菌的輪廓更加清晰，此時細菌的長度約為2.36 μm，直徑約為0.85 μm，這與文獻報告相似[18,21]。

2 自愈合混凝土的制備

2.1 微生物制劑的制備

應按微生物培養法對具有礦化沉淀能力的細菌凍干粉進行活化，步驟如下[27-28]：

(1)培養基配制。培養基各個成分如表1；(2)培養基及器皿滅菌。將實驗所需的所有器皿(如玻璃平板、離心管)，與培養基一起放入高壓鍋中在121 ℃下高溫滅菌20 min；(3)倒平板。在含有瓊脂粉的培養基冷卻凝固前，在超凈臺內按照常規的微生物培養平板制備方式制備細菌活化需要的瓊脂平板；(4)細菌活化。取出保存在-80 ℃冰箱的菌種，用液氮保藏直接放入室溫下的培養基放入溫水中，待變成液體狀態；若細菌呈現凍干粉狀態，則需要取1 mL培養基溶液使其變成液體狀態；(5)細菌懸浮液涂平板。在酒精燈上對鑷子進行消毒；(6)封口以及恒溫培養。將接種后的平板利用封口膜封住，防止染菌。封口完成后將平板置于恒溫培養器中在 37 ℃下恒溫培養24 h。

圖5 原子力顯微鏡下枯草芽孢桿菌M9菌株的形貌Fig 5 AFM image of Bacillus subtilis M9 strains

表1 LB培養基成分配比

2.2 混凝土澆筑成型

為了生產自愈合混凝土，需要為細菌設計生態位，使其占據一定的空間環境，包括食物、庇護所，以供其生存和繁殖。三萜皂甙引氣劑，可降低混凝土中的水表面張力，其設計初衷是為了更好地分散和防止混凝土滲水[29]。它引入了大量的微氣泡，直徑為50～100 μm，為微生物提供了合適的空間[30]。

傳統的砂漿混凝土材料容易發生脆性破壞，通常需要預埋鋼筋或纖維來克服這類問題。纖維對混凝土基體的貢獻始于裂紋的出現，由于連接裂紋截面的纖維提供了更好的應力傳遞，使得混凝土開裂后繼續提供應力，并阻止裂紋的進一步擴展[31]。為了更好地評價纖維混凝土的裂縫愈合特性，本文制備的纖維混凝土在彎曲條件下產生理想的預制裂縫，采用的是聚乙烯醇(PVA)纖維，與水泥漿體具有良好的相容性而備受關注[32]。

將細砂、水、水泥、粉煤灰、PVA纖維和菌液、鈣源組成的微生物自愈劑混合制成40 mm×40 mm×160 mm的混凝土砂漿試件。混凝土配合比如表2所示，其中硅酸鹽水泥(P.I42.5)為膠凝材料，粉煤灰為礦物活性細摻合料。水膠比為0.25，砂膠比為0.45。改性PVA纖維由中國開元化工股份有限公司生產，長度12 mm，直徑26 μm，拉伸強度1 000 MPa，楊氏模量8 GPa。為了改善纖維增強基體的流動性，還添加了高性能聚羧酸高效減水劑[33]。

表2 自愈合混凝土配合比

為保證裂縫處有足夠的愈合劑，澆筑時用細菌溶液代替10%的水溶液，以保證較高的微生物濃度[34]，細菌溶液為培養24 h后，進入穩定期的狀態，稀釋后的細菌溶液濃度為2.1×107cells/ml。自愈合混凝土的具體攪拌程序如下。首先，將引氣劑和減水劑加入水中，充分攪拌30 s；再將水泥、粉煤灰和攪拌后的水投入攪拌機內先慢攪60 s，再快攪30 s；在攪拌期間，根據砂漿的流動性判斷是否需要再加入適量的減水劑，等待出現流動性較好的砂漿狀態時，再加入乳酸鈣和砂子，繼續慢攪60 s，快攪30 s；最后加入PVA纖維，攪拌最后一個流程，慢攪60 s，快攪30 s；將拌制好的混凝土裝入40 mm×40 mm×160 mm的標準三聯模中，在振動臺上振實、抹平。以60 s為一個流程，振動兩個流程，以防止和泥土出現分層、離析現象。試件成型后，在混凝土表面覆蓋一層塑料薄膜以防止水分流失，并在(20±5)℃的環境中靜置一晝夜。然后對混凝土進行編號、拆模，按照混凝土養護標準，在相對濕度為95%以上的標準養護條件下繼續養護13 d。

3 裂縫密封性評估

3.1 預制裂紋

混凝土結構中的裂縫是由機械荷載或收縮引起的。雖然人工插入薄板形成的裂縫看起來比較均勻，形狀規則，但裂縫表面與實際情況并不一致，無法評價纖維橋接效果的愈合情況。所以本文采用三點彎曲試驗，使混凝土梁從底部產生一條裂紋，沿著梁頂方向擴展，更符合工程實際情況。

使用萬能試驗機進行三點彎曲試驗。支承梁跨度為12 cm，載荷單元通過位移控制作用于梁的中心，用伸長計記錄裂紋張開位移(CMOD)。為了保證準靜態加載條件，垂直加載速度為0.1 mm/min。記錄每次彎曲試驗的Load-CMOD曲線，直到最終CMOD達到0.3 mm。然后反向卸載，直到負載返回到零。抗彎強度可通過公式(6)得到，

(6)

式中：F是峰值荷載，L是跨度，b和h是梁截面的寬度和高度。

6個梁試件的抗彎強度范圍為3.63～4.88 MPa，如表3所示。1～3號試件屬于第一批，4～6號試件屬于第二批，彎曲強度略有差異。一般來說，經過14 d養護后的自愈合混凝土具有較高的抗折強度，符合建筑工程的正常要求。

表3 自愈合混凝土梁彎曲強度

3.2 裂紋修復

在彎曲試驗后，仔細收集了6個裂紋梁試件，這些試件底部最大裂縫寬度約為0.3 mm。Wiktor和Jonkers[34]將砂漿樣本浸泡在水下以修補裂縫。但水阻止了細菌從大氣中自由獲取氧氣和二氧化碳，這是化學反應(1)～(4)所表明的MICP的關鍵因素。本研究通過向裂隙區域噴灑乳酸鈣溶液，改善裂縫表面孢子的生存環境，使裂縫表面的孢子更好地萌發和繁殖。在養護修復期內，將預制裂紋的試樣放置在溫度為(35±2)℃，相對濕度≥95%的室外養護箱中，并保持一定的通風，提供充足的O和CO2，為細菌提供一個相對理想的環境。

圖6是養護修復28 d后的自愈合混凝土梁試件，裂縫寬度最大的梁底(～0.30 mm)是自愈評價的重點。幸運的是，觀察到白色碳酸鈣完全填補了梁底的裂縫。左邊的照片讓我們可以更近距離地看到完全修復的裂縫。在愈合過程中，顯微鏡記錄裂紋部分封閉的狀態。值得注意的是，裂紋兩側形成的晶體以不同的速度填充裂隙，即一側可能積累更多的礦物，而另一側的晶體較少。在右邊的照片中，在微生物砂漿樣品表面清晰可見CaCO3晶體，填充了彎曲形成的主裂紋和表面孔隙，裂紋修復寬度在0.26～0.32 mm之間，這已在文獻中報道過[35]。

圖6 試件裂紋自修復效果Fig 6 Crack sealing of specimen sample

3.3 抗折強度評估

由于方解石晶體本身具備較高的強度，人們相信通過用方解石修補裂縫的方式，自愈合混凝土可以恢復一些強度[36]。預制裂紋自愈合28 d后，對梁試件重復進行三點彎曲試驗，以測試因自愈合而恢復的抗彎強度。由于裂縫是在養護半個月后產生的，在裂縫愈合過程中仍可能會有一定的水泥水化。Wang等[37]測試了沒有添加愈合劑的砂漿混凝土，沒有發現明顯的強度恢復。因此我們可以認為，由于混凝土試件的自愈能力，重復彎曲試驗可以評估修復后的混凝土試件的恢復抗折強度。

獲得了第二次彎曲強度，并與第一次彎曲強度和剩余彎曲強度進行了比較，如表3所示。圖7描述了三點彎曲試驗和自愈過程中的強度變化。所有試件經微生物修復后均表現出一定的強度恢復，如2號、5號和6號試件的強度恢復到0.33～0.75 MPa。與剩余強度相比，這三種試件的強度恢復率均在15%以上。

圖7 彎曲強度的恢復情況Fig 7 Flexural strength regain

在強度恢復現象最明顯的情況下，2號試件的加載、卸載和再加載響應如圖8所示。在達到峰值荷載后，混凝土受拉破壞產生裂縫，應力突然下降，之后由纖維繼續承擔，最后進入平穩期。當CMOD達到0.3 mm時，將MTS機調整為以0.1 mm/min進行卸載，Load-CMOD曲線呈下降趨勢，直到約0.26 mm。自愈合梁修復后，再次進行加載試驗。值得注意的是，再次加載響應下降段相對較平緩，峰值荷載遠大于首次彎曲結束時的殘余荷載。由此，我們可以認為混凝土的自愈合作用，使得混凝土強度得到一定的提升。

圖8 兩次三點彎載荷下試件的力學響應Fig 8 Mechanical response of repeated 3-point bending load

方解石的析出填充了裂隙，使得斷裂面的強度得到一定的恢復。利用微生物誘導碳酸鈣沉淀來修復裂縫，宏觀上有助于結構強度的恢復。此外，還對拔出后的PVA纖維進行了SEM測試。圖9是纖維表面細節圖，顯示了纖維的損傷程度和附著情況。放大10 000倍后，可以清晰的看到纖維表面的劃痕，表明纖維與其周圍基體之間存在滑移和剪切摩擦相互作用。同時纖維表面有零散的碳酸鈣晶體析出，這是因為MICP的自愈合機制，纖維-基體界面附近的微裂紋也得到了修復。

圖9 PVA纖維拔出后的掃描電鏡圖像Fig 9 SEM image of PV A fiber after pullout

3.4 裂紋填充礦物的表征

用掃描電鏡分析從斷口采集的微量礦物樣品，從圖10(a)～(c)中可以看出，方解石是碳酸鈣最主要的沉淀形式，這些晶體按照一定的順序堆疊排列，規則整齊，但仍有一些是不規則六面體及類球狀顆粒，且顆粒尺寸相對更大，如10(d)所示。在碳酸鈣的沉積過程中，許多外界條件都會直接影響碳酸鈣的晶型和形貌[38]，比如說不同外加鈣源，其中含有的不同官能團會對碳酸鈣形貌產生一定的影響；同時在混凝土中所處的環境，過高的堿性環境也會導致不同類型的碳酸鈣產生。

圖10 裂紋填充物的電鏡照片Fig 10 SEM image of crack filler

如文獻[19]所述，微生物的代謝活動導致碳酸鹽濃度和pH的升高，進而促進CO2向碳酸鹽的轉化。隨后Ca(OH)2與CO2的碳化作用也促使了方解石的析出，從而封閉了裂縫。上述兩個化學反應方程式為：

CaC6H10O6+6O2→CaCO3↓+5CO2+5H2O

(7)

Ca(OH)2+CO2→CaCO3↓+H2O

(8)

隨著晶體的形成，細菌在成核處的生存環境變得非常惡劣，即與水、營養和空氣隔絕。在圖11中，可以看到在碳酸鈣晶體表面有一些類似于細菌形狀的印記，可以猜測這是細菌礦化沉淀后移動留下的痕跡。這一現象也被前人所記錄，為碳酸鈣礦物的沉淀演變提供了重要依據。

圖11 生物礦化作用對細菌的封裝Fig 11 Encapsulated bacteria due to biomineralization

4 結 論

本文對自愈合混凝土制劑的菌劑進行了篩選，進而制備了一種自愈合混凝土。對11種有效的枯草芽孢桿菌在相對較高pH條件下的生長周期進行了吸光度OD600測定。選用耐堿枯草芽孢桿菌M9作為自愈合混凝土的配制劑。通過三點彎曲試驗，在底部預制產生約為0.3 mm的裂縫。通過掃描電鏡對礦物沉淀進行分析，以及修復后梁的反復彎曲試驗，對裂縫愈合情況進行了評價。得出以下幾個結論：

(1)微生物誘導碳酸鈣沉淀的研究結果表明，與通過化學方法得到的碳酸鈣晶體相比，微生物誘導形成的碳酸鈣，為穩定的方解石晶體且更加致密。

(2)對自愈合混凝土梁進行三點彎曲試驗，最大抗彎強度為4.2 MPa。自修復養護28 d后，對自愈合梁進行第二次三點彎曲實驗，抗彎強度提高0.34 MPa，強度恢復率約14%。抗彎強度的恢復來自于裂縫的填充和纖維-基體界面粘結的修復。

(3)彎曲梁的斷裂面呈熒光狀邊緣輪廓，與細菌旺盛區相對應。這主要是由于混凝土表面碳化導致pH值偏低，而內側混凝土基質pH值較高且相對干燥的環境，不利于微生物的生存。因此，隨著裂紋深度的增加，愈合速率急劇下降。這一缺陷嚴重阻礙了微生物自愈技術在實際工程中的應用。

(4)對自愈合混凝土中析出的裂紋填充礦物進行了掃描電鏡測試。主要是呈六邊形的碳酸鈣晶體，并有細菌留下的清晰印記。

(5)在掃描電鏡測試中發現PVA纖維由于剪切摩擦和滑移而出現劃痕。拔出后的纖維表面附著碳酸鈣晶體，表明纖維-基體粘結界面正在修復。