人參皂苷Rb1對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護作用*

郝廣煜，方 剛，代玉晶，李 娟，侯瑞麗，賈建新，楊占君，霍東升

(包頭醫學院，內蒙古 包頭 014040)

人參屬植物具有重大的藥用價值，人參(Panax ginseng Meyer)和三七(P. notoginseng (Burk) F. H. Chen)都是人參屬植物中的藥材。人參皂苷Rb1是從人參提取出的最豐富的生物活性形式，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等生物活性[1]。研究證實，神經退行性疾病的發生與機體的氧化產物水平增加有著密切的關系。腦內含有大量的脂質且耗氧量較高，活性氧(reactive oxygen species, ROS)蓄積引起的損傷可能是疾病發生發展的重要原因之一[2]。因此，延緩神經退行性疾病的有效治療方法之一可能就是通過抗氧化劑清除過量的ROS。H2O2屬于活性氧自由基，為主要的ROS之一，是引起氧化應激的一個中介物。PC12細胞來源于褐家鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，在體外培養時與神經元生長特征相似，廣泛應用于研究神經細胞的功能、分化和死亡領域。趙立理等研究發現H2O2可引起PC12細胞氧化應激損傷，細胞活力下降[3]。帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的老年神經系統退行性疾病，致病過程復雜，氧化應激是其眾多致病因素之一。本實驗采用H2O2構建PC12細胞損傷模型，通過檢測細胞活性，探討人參皂苷Rb1對H2O2誘導PC12細胞損傷模型的影響，為人參皂苷在PD方面的治療研究提供理論參考依據，同時也為中藥材資源的開發與利用積累資料。

1 材料與方法

1.1實驗材料 PC12大鼠嗜鉻瘤細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。人參皂苷Rb1購自上海同田生物技術有限公司。DMEM高糖培養基、馬血清為美國Gibco公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；RNAiso plus、PrimeScript反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 均購自TaKaRa大連公司；引物HO-1和GCLC由生工生物工程(上海)有限公司合成；DMSO和青霉素、鏈霉素購自海克隆生物化學制品(北京)有限公司)；噻唑藍(MTT)購自sigma公司；30 %過氧化氫(H2O2)購自天津富宇試劑有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1PC12細胞培養 PC12細胞用含5 %胎牛血清、5 %馬血清、100 mg/L青霉素，100 mg/L鏈霉素的DMEM培養液于37 ℃、5 % CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2.2人參皂苷Rb1對PC12細胞增殖的影響 細胞按1×105個/mL接種于96孔細胞培養板中，每孔加100 μL，37 ℃、5 % CO2條件下孵育12 h后，分別加入系列濃度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL) 的人參皂苷Rb1。同時設空白對照組(未加人參皂苷Rb1)，每組設置3個平行孔。培養24 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min后，用酶標儀測量各孔的吸光度值(OD 570 nm)。根據公式：細胞存活率=[(藥物孔OD值-本底對照孔OD值) /(對照細胞孔OD值-本底對照孔OD值)]×100 %計算細胞存活率。

1.2.3人參皂苷Rb1對H2O2誘導PC12細胞氧化損傷的保護作用 取對數期PC12 細胞，濃度調整為1×105個/mL并接種于96孔細胞培養板，每孔加100 μL，37 ℃、5 % CO2條件下孵育12 h后，棄去原培養液，將PC12細胞分為對照組、模型組和實驗組。實驗組加入系列濃度的人參皂苷Rb1(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)溶液，模型組和對照組加入DMEM完全培養基，終體積為100 μL/孔，預處理12 h。待處理結束后，模型組和實驗組直接加入H2O2溶液，終濃度為400 μmol/L，對照組加入等體積DMEM完全培養基。每組設置5個平行孔。培養24 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min后，用酶標儀測量各孔的吸光度值(OD 570 nm)并計算細胞存活率。

1.2.4HO-1和GCLC基因的轉錄水平分析 按上述方法培養細胞，1 000 r/min離心10 min收集細胞，重懸于1 mL RNAiso plus中提取總RNA。以0.5 μg RNA為模板按 PrimeScript反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA。擴增引物：HO-1 forward (5'-GCCTGCTAGCCTGGTTCAAG-3') 和HO-1 reverse (5'-AGCGGTGTCTGGGATGAACTA-3')[4]；GCLC forward (5'-GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3') 和GCLC reverse (5'-TGTTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3') ；GAPDH forward (5'-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3') 和GAPDH reverse (5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3') ，反應體系按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ反應液配制說明配制。檢測樣品做3個重復，且至少3次獨立重復實驗。擴增程序為：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40個循環。數據分析通過待測基因與內參基因Ct值的差值來計算基因表達差異，即基因表達水平變化倍數= 2-[(干預后待測基因-干預后參照基因)-(干預前待測基因-干預前參照基因)]。

2 結果

2.1人參皂苷Rb1對PC12細胞增殖的影響 采用MTT法檢測人參皂苷Rb1對PC12細胞增殖活性的影響。結果顯示，與空白組比較，人參皂苷Rb1系列濃度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)對PC12細胞的增殖作用無顯著性差異(P>0.05)。實驗結果表明，在實驗濃度范圍內人參皂苷Rb1對細胞增殖無影響，無細胞毒性作用(圖1)。

2.2人參皂苷Rb1對H2O2誘導PC12細胞氧化損傷的影響 MTT法檢測細胞存活率如圖2所示，與正常對照組比較，模型組顯著地降低PC12細胞存活率(P<0.001)；與模型組比較，實驗組不同濃度人參皂苷Rb1(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)培養24 h后細胞的存活率升高，且呈劑量依賴性增高，0.2 mg/mL和0.4 mg/mL組細胞存活率顯著性增高(P<0.001)。

圖1 人參皂苷Rb1對PC12細胞增殖的影響

圖2 人參皂苷Rb1對PC12細胞存活率的影響

2.3人參皂苷Rb1對PC12細胞的HO-1基因轉錄水平的影響 利用qRT-PCR方法，檢測人參皂苷Rb1對PC12細胞HO-1基因的轉錄水平的影響。研究結果顯示，與模型組比較，人參皂苷Rb1(0.4 mg/mL)組的HO-1基因轉錄水平顯著升高(P<0.001，圖3A)，而對照組的HO-1基因轉錄水平無顯著性差異(P>0.05，圖3A)；人參皂苷Rb1(0.4 mg/mL)組的GCLC基因轉錄水平與模型組、對照組均無顯著性差異(P>0.05，圖3B)。

圖3 人參皂苷Rb1對PC12細胞的HO-1

3 討論

目前，針對PD不同病因已在體外建立了多種細胞模型，例如氧化應激損傷模型、缺糖缺氧模型等，它們具有周期短、條件易控、便于重復等優點。PC12細胞有神經內分泌細胞特征，且易存活、可傳代、增殖快，被廣泛應用于神經系統疾病藥物篩選及機制研究中[5]。大量研究表明，自由基損傷是造成PD的重要原因之一，其中ROS與PD發病有著密切的關系。ROS生成過多而體內活性酶的清除能力下降，使得機體處于氧化應激環境之中[6,7]。H2O2作為氧化損傷的誘導劑，化學性質活躍，易于出入細胞，引起細胞毒性而導致細胞死亡。細胞毒性檢測主要根據細胞膜通透性的變化。常用的檢測方法有MTT、CCK8和LDH等，用于檢測細胞存活率。實時無標記細胞分析技術(RealTime Cellular Analysis，RTCA)是近幾年出現的新技術手段，可以實時、動態、定量跟蹤細胞形態和增殖分化。本研究結果發現，模型組的細胞存活率顯著低于正常對照組，提示H2O2誘導細胞損傷模型成功建立。實驗組細胞存活率高于模型組，呈劑量依賴性增高，劑量達到0.2 mg/mL出現統計學差異，表明人參皂苷Rb1能夠降低PC12細胞中H2O2誘導的細胞損傷。目前大量的研究證據表明，ROS不但有信號轉導和調控細胞活性生理功能，還可參與介導多種炎癥介質的生物學活性作用及直接或間接損傷細胞的結構[8]。H2O2暴露可增加細胞內ROS或直接參與氧化應激，誘導自由基產生，導致細胞損傷。人參皂苷Rb1可能是通過其抗氧化活性減少自由基產生，降低氧化應激，從而對細胞起到保護作用。

血紅素加氧酶(heme oxygenase, HO)是血紅素分解代謝過程中的限速酶。HO有三種類型：氧應激誘導型HO-1、組成型HO-2及尚未明確的HO-3。HO -1本身及其代謝產物均有抗氧化損傷的功能，臨床上以HO-1的表達量作為組織氧化應激水平的重要參考。研究證實，HO-1基因的上調對細胞氧化損傷具有保護作用[9]。本研究結果顯示人參皂苷Rb1能夠上調細胞內HO-1基因表達，提示人參皂苷Rb1可能通過上調HO-1基因表達發揮對H2O2誘導細胞損傷的保護作用，其上調機制還需進一步驗證。

綜上所述，人參皂苷Rb1能夠對抗H2O2誘導的細胞損傷，提高細胞存活率，起到保護作用。人參皂苷Rb1可能是通過上調HO-1基因表達，增加抗氧化能力，降低氧化應激損傷而完成，具體機制還需進一步設計實驗驗證。