探頭式共聚焦激光顯微內鏡在微創保膽手術中的應用*

湯泊夫，賈語婧，劉 琳，王秋紅，韓唯杰，常志恒，黨 彤

(內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院內蒙古消化病研究所，內蒙古包頭 014030)

膽囊結石、膽囊息肉是臨床常見的膽囊病變，近年來發病率逐年升高。全球成年人膽囊結石患病率達10.0 %～20.0 %[1]，膽囊息肉患病率也在0.3 %～12.3 %[2]。近年來，腹腔鏡膽囊切除術，逐漸成為治療膽囊良性病變的“金標準”。但是膽囊切除后的并發癥，包括血管損傷、膽道損傷、患右半結腸癌風險增加、膽囊切除術后綜合征(胃-十二指腸返流、長期腹瀉、脂肪瀉等)卻長期得不到應有的重視[3-5]。1985年，Akiyama等[6]首次報道保膽取石手術，最大限度保留膽囊功能，防止上述并發癥出現。隨著膽道鏡技術不斷成熟，出現了內鏡微創保膽手術(choledochoscopic gallbladder-preserving surgery，CGPS)治療膽囊良性疾病[7]。因CGPS術前診斷依靠超聲、CT、MRI等影像學結果，無法對膽囊黏膜進行直觀的檢查，有漏診膽囊癌前病變甚至膽囊癌的可能，越微小、越早期的病變越容易被漏診[8]；且CGPS無法獲得術后膽囊大體標本，術中冰凍切片等待時間較長，延長手術時間，增加手術風險，取材部位局限，還可能出現漏診。

探頭式共聚焦激光顯微內鏡(probe-based confocal laser endomicroscopy,pCLE)，是一種新型內鏡，可通過多種內窺鏡鉗道，具備即時的虛擬組織學成像與檢測功能,獲得放大500～1 000倍的內鏡圖像,可以實時進行黏膜的細胞層面掃查,有助于進行靶向活檢,可顯著提高消化系統腫瘤發現率,被譽為“光活檢”或“光學切片”[9]。pCLE在診斷消化系統疾病方面已有較多研究，尤其在病變良惡性鑒別、微小病變診斷方面有很高的準確性，具有準確、快速、實時的特點。pCLE在膽囊疾病方面的應用鮮有報道，且尚無保膽手術中應用pCLE的相關研究報道。本研究在CGPS術中應用pCLE進行全膽囊黏膜掃查，無創替代傳統游離膽囊病理，結合術前影像學診斷、術后病理診斷與術中pCLE診斷對照，分析pCLE在膽囊疾病診斷方面的準確率，評估pCLE在CGPS中的應用價值；結合病理診斷結果，歸納不同膽囊疾病中pCLE下膽囊黏膜特點，初步建立pCLE膽囊疾病圖譜，充實CGPS評估指標，完善CGPS標準。

1 對象與方法

1.1對象 選取2019年9月-2020年7月28例擬行CGPS+pCLE膽囊檢查患者。患者中男性7例，女性21例；年齡26～71歲，平均51.75歲。納入標準：(1)年齡18～80歲；(2)術前腹部彩超、MRI、CT等檢查診斷膽囊結石或膽囊良性息肉；(3)同意行CGPS+pCLE；(4)熒光素鈉過敏實驗陰性；(5)無膽囊急性水腫;(6)膽囊壁厚度<4 mm;(7)膽囊收縮功能大于正常水平的30.0 %。排除標準:(1)膽囊萎縮或瓷性膽囊;(2)懷疑膽囊惡性腫瘤;(3)膽道梗阻;(4)凝血功能嚴重異常；(5)精神疾病不能配合手術。患者均簽署知情同意書，本研究獲包頭醫學院第二附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1pCLE診斷標準 目前尚無膽囊黏膜相關pCLE診斷標準，故參照pCLE相關診斷標準[10]及膽囊黏膜組織學特征，定義了pCLE下不同膽囊狀態的診斷標準。具體標準為：(1)正常膽囊黏膜：由單層高柱狀上皮細胞、少量基底細胞及特征性的鉛筆樣細胞組成，無杯狀細胞、黑色素細胞，僅膽囊頸部存在真腺體；(2)慢性膽囊炎：可見幽門腺化生及增多的阿-羅氏竇；(3)固醇性息肉：可見大量泡沫樣巨噬細胞；(4)腺瘤性腺瘤：可見不規則或絨毛狀腺體結構，上皮不規則增厚；(5)腺癌：絨毛狀結構紊亂或喪失、細胞形態不規則、細胞邊界模糊和不規則血管擴張。參考pCLE相關診斷標準[10]，選擇微血管直徑(microvessel diameter，MVD)、微血管走行(microvessel run，MVR)、細胞直徑(cell diameter,CD)、細胞形態(cell morphology，CM)、細胞間距(cells spacing，CS)、腺體形態(gland morphology，GM)等6個指標，比較各指標在不同狀態下膽囊黏膜的差異性，評估各指標在診斷各類膽囊疾病中的意義，量化pCLE在膽囊疾病中的診斷標準。

1.2.2操作過程 (1)術前評估：患者具備行全身麻醉下CGPS的條件，熒光素鈉過敏實驗陰性(2.0 %，1 mL靜脈注射，觀察30 min，無心慌、氣促、呼吸困難、皮疹等)。(2)手術過程：在包頭醫學院第二附屬醫院手術室進行，手術團隊包括3名外科醫師及1名pCLE醫師。術中使用腹腔鏡、膽道鏡及pCLE。患者全麻仰臥位，采用閉合CO2氣腹技術，建立10 mm臍孔置入腹腔鏡，腹腔壓力維持在10～12 mmHg。劍突下、右上腹放置2個Trocar，以引入手術器械。根據結石大小在膽囊體部做一切口，吸引器吸出膽汁，膽囊腔內置入可彎曲式膽道鏡，用5.0 %葡萄糖水沖洗膽囊腔，清洗附著在膽囊壁上的膽汁及黏液、充盈膽囊腔。膽囊結石通過取石網籃取出或用抽吸法取出。(3)pCLE檢查：結石取凈后，靜脈注射熒光素鈉(10.0 %,2 mL,Alcon Laboratories,Inc.)30 s后，從膽道鏡孔道中置入pCLE(Cholangioflex, Mauna Kea Technologies,法國)探查膽囊黏膜，可彎曲式膽道鏡輔助pCLE移動。(4)進一步治療：根據pCLE檢查結果，正常膽囊用活檢鉗(Radial JawTM 4,波士頓科學，美國)在經典部位取材送活檢，膽囊良性息肉用熱活檢鉗行電切除，腫瘤性病變或癌前病變行膽囊切除術，所有標本送病理科行組織學檢查。用3-0可吸收線縫合膽囊體部切口，觀察無活動出血、無膽汁漏出后關腹。(5)術后處理：術后觀察24 h，患者無出血、穿孔等并發癥，術后24 h進食，術后72 h出院。術后3個月隨訪肝功能、腹部超聲等檢查。

2 結果

2.1pCLE診斷與病理結果 納入的28例患者中，共獲得29段pCLE檢查錄像，根據pCLE圖像獲得29個pCLE診斷；送檢標本29例，獲得29個術后病理診斷結果。其中，19例患者術中pCLE膽囊掃查診斷為正常膽囊黏膜，術后病理結果與pCLE一致；1例術中發現小網膜隆起，術中pCLE檢查考慮惡性腫瘤，行膽囊切除+小網膜隆起切除術，術后膽囊病理未見異常，小網膜隆起病理結果考慮血管源性腫瘤；8例術中發現膽囊息肉樣病變，術中pCLE考慮膽固醇性息肉5例(行息肉電切術)，腺瘤性息肉2例、惡性腫瘤1例(3例行膽囊切除術)；術后病理顯示膽固醇性息肉5例，腺上皮低級別瘤變2例，中分化腺癌1例。本次研究中，術中pCLE與術后病理結果對照，準確率達100 %。見表1。

2.2不同膽囊狀態下pCLE特點

2.2.1正常膽囊黏膜 pCLE下為高亮的背景和直徑為5～10 μm的黑色細胞，細胞間可見直徑約10 μm的微血管，局部可見約50 μm×120 μm的腺體樣結構，中央黑色，邊緣為高亮的刷狀緣，排列整齊。

表1 患者術前、術中、術后診斷情況表

其中，膽囊底黏膜背景透亮，細胞排列稀疏，可見袢狀微血管；膽囊體可見大量灰色背景細胞，直徑5～10 μm線性微血管；膽囊頸可見較多橢圓形腺體，邊緣可見大量柱狀腺細胞之間少量鉛筆樣細胞，呈刷狀緣排列。部分病例可見少量約25 μm×40 μm的類似腺體結構，結合術后病理，考慮為阿-羅氏竇。

2.2.2膽固醇性息肉 pCLE下呈緊密排列的黑色圓形細胞，細胞邊緣清晰，排列整齊，密度尚均勻，直徑約20 μm，周圍黏膜缺乏血供，息肉基底部為正常膽囊背景細胞。

2.2.3腺瘤性息肉 pCLE下可見明顯增大的腺體，邊緣為整齊、拉長的腺細胞，細胞界限清晰，腺體排列較正常腺體緊密。與正常腺體不同的是，腺瘤性息肉腺體由許多黑白相間的腺細胞組成，直徑約40 μm。腺體之間可見直徑約20 μm的線性微血管。

2.2.4血管源性腫瘤 pCLE下呈大量大小不一、排列紊亂的黑色細胞，細胞直徑20～40 μm，間隙中可見大量5～10 μm的微血管袢。因為此病變是在小網膜發現的，病變周圍可見大量透亮背景下排列整齊、大小不等的四邊形黑色脂肪細胞。

2.2.5腺癌 pCLE下呈團塊狀，細胞極向紊亂，大小不等，形狀不規則，細胞邊界模糊，腺體極度不規則，局部腺體消失，腺體之間可見直徑>40 μm、走行扭曲的微血管。

2.3各形態指標在pCLE診斷不同膽囊疾病中的意義 與正常膽囊黏膜相比，本研究預先建立的MVD、MVR、CD、CM、CS、GM等6個指標中，膽固醇性息肉在CD上有區別，腺瘤性息肉在MVD、CD、GM方面有區別，腺癌在MVD、MVR、CD、CM、GM上差異均有統計學意義(P<0.05)，而CS在膽囊正常黏膜與各種疾病之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、表3。

表2 不同膽囊疾病黏膜pCLE形態特點

表3 不同膽囊疾病黏膜pCLE下MVD、CD、CS值與正常膽囊黏膜差異性比較[P,95 %CI]

3 討論

大量研究表明，共聚焦激光顯微內鏡(confocal laser endomicroscopy，CLE)在消化系統疾病診斷和應用方面具有獨特的優勢，可獲得與病理準確性相當的診斷結果[11]，尤其在早期疾病診斷、判斷病變良惡性、或癥狀較輕時微小結構的改變有著不可替代的優勢[12-13]。CLE可大大提高靶向活檢的效率，更大程度保持病變完整，有利于后續治療[14]。在膽胰疾病診斷方面，CLE因其“活體病理”的優勢可在無創傷的前提下獲得更多病理信息，配合現有的內鏡診斷技術，診斷準確率及操作時間均優于細胞學檢查。一項薈萃分析[15]指出，CLE診斷胰腺漿液性囊腺瘤的準確率高達88.6 %，敏感性和特異性分別為82.4 %和96.6 %，對比單純超聲內鏡下細針穿刺，CLE更準確(OR=3.94,95 %CI=1.58-9.82;P=0.003)，且平均操作時間僅6.094 min，可快速、高效、準確地診斷胰腺囊性疾病。

在CGPS中，對于膽囊潛在惡變風險或“意外膽囊癌”等情況[16]無法作出可靠的判斷和及時的應對。pCLE通過可彎曲式膽道鏡的輔助迅速對全膽囊黏膜進行掃查，實現術中“活體病理”診斷。本研究中共有28例擬行CGPS患者，通過術中pCLE檢查，有14.3 %(4/28)的患者術中改變手術方案，行腹腔鏡下膽囊切除術。術后病理結果也證實了pCLE的準確性(100 %，28/28)。所有pCLE檢查均在15 min內完成，體現出pCLE的高效性。pCLE具備實時、無創、準確、快速、高效等特點，是對CGPS術中診斷很好的補充。

結石復發是目前CGPS術后主要并發癥之一[17]。CGPS術前診斷依賴超聲、CT、MRI等影像學結果，有漏診癌前病變甚至癌的可能，越微小、越早期的病變越容易被漏診。有研究認為CGPS術后膽囊是膽囊癌的危險因素之一[8]。本研究中，pCLE在膽囊頸部發現阿-羅氏竇結構。阿羅氏竇的增多是慢性膽囊炎癥的重要表現之一。膽囊慢性炎癥的程度與周期是膽囊癌、膽囊結石形成的因素之一[8,17]。通過pCLE對阿-羅氏竇的觀察與分析，或許能為CGPS術后膽囊結石復發、膽囊癌發生等的相關因素提供新的依據。

本研究初步對膽囊正常黏膜、膽固醇性息肉、腺瘤性息肉及腺癌的pCLE表現作出了特征性描述，通過對比各微觀指標差異性，發現微血管直徑、微血管走行、細胞直徑、細胞形態、腺體形態等5個指標可能會成為pCLE診斷膽囊疾病標準的指標。由于本研究總體樣本量不大，其中膽囊腺瘤性息肉、腺癌樣本量較小，需要以后大樣本量研究的進一步支持與驗證。

綜上所述，本研究利用pCLE作為CGPS術中診斷，說明其具有實時、無創、準確、快速、高效的特點，在臨床應用中具有很大的潛力和廣闊的前景。