遺傳修飾小鼠模型基因型鑒定技術(shù)要點(diǎn)介紹*

劉甦蘇 王辰飛 岳秉飛 李冠名 范昌發(fā)

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 102696)

遺傳修飾小鼠模型是基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)研究中不可或缺的工具，在研究人類(lèi)疾病相關(guān)基因功能、疾病表型、診斷及治療等方面都起著重要作用[1]。近年來(lái)，動(dòng)物模型制作成為研究熱點(diǎn)，針對(duì)小鼠的基因修飾技術(shù)也在不斷更新，出現(xiàn)了各種類(lèi)型的遺傳修飾小鼠模型，比較常見(jiàn)的分為隨機(jī)轉(zhuǎn)基因小鼠、條件性基因敲入小鼠、基因敲除小鼠三類(lèi)[2-5]。由于制作方法不同，其基因型鑒定方法也不一樣，目前很多實(shí)驗(yàn)人員并不能很好的掌握該類(lèi)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)要點(diǎn)，從而導(dǎo)致基因型鑒定工作存在混亂無(wú)序的現(xiàn)象。本文從基因型鑒定實(shí)驗(yàn)總體原則、三類(lèi)模型的設(shè)計(jì)原理、鑒定引物設(shè)計(jì)原則及結(jié)果判定這幾個(gè)方面介紹了基因型鑒定技術(shù)要點(diǎn)，規(guī)范基因型鑒定技術(shù)方法，保證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)確性，從而推動(dòng)動(dòng)物模型在基礎(chǔ)和應(yīng)用科技領(lǐng)域的應(yīng)用與發(fā)展。

1 基因型鑒定實(shí)驗(yàn)總體原則

1.1 DNA模板的質(zhì)量控制

DNA模板的質(zhì)量控制是基因型鑒定實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵因素之一，目前多采用苯酚-氯仿提取法、試劑盒法或者更加簡(jiǎn)單的煮沸法來(lái)提取。選擇具體DNA模板制作方法時(shí)，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)選擇不同的提取方法。如果旨在獲得初步的基因型鑒定結(jié)果，可以采用簡(jiǎn)單快速的煮沸法提取模板DNA，但此法制備的模板雜質(zhì)含量較高、濃度較低，有時(shí)候擴(kuò)增困難。而苯酚-氯仿和試劑盒提取法提取的DNA模板質(zhì)量較高，適合用于較為正式的基因型鑒定實(shí)驗(yàn)[6]。DNA質(zhì)量與濃度可通過(guò)吸光值法判定，DNA的完整性則可以通過(guò)電泳判斷。

1.2 PCR反應(yīng)體系的質(zhì)量控制

PCR反應(yīng)體系的制備[7]也是基因型鑒定實(shí)驗(yàn)的重要部分，應(yīng)要考慮以下幾點(diǎn)：

1.2.1DNA聚合酶的選取：目前市售多種DNA聚合酶，不同的DNA聚合酶，其價(jià)格與性能均不同。有的適用于一般PCR擴(kuò)增，價(jià)格較低，但錯(cuò)配率較高，無(wú)法擴(kuò)增較長(zhǎng)的片段。有的DNA聚合酶適合用于擴(kuò)增長(zhǎng)片段，有的適合用于高保真擴(kuò)增，有的適用于高GC含量的模板DNA擴(kuò)增，可以根據(jù)模板DNA情況，選擇合適的聚合酶與反應(yīng)體系。

1.2.2退火溫度的優(yōu)化：一對(duì)新合成的引物會(huì)給出參考Tm值，但為了穩(wěn)定起見(jiàn)，建議對(duì)其退火溫度優(yōu)化，可采用梯度PCR儀，通過(guò)設(shè)置不同的退火溫度的辦法，獲得最佳的退火溫度。目的條帶清晰，雜帶少或者無(wú)可判定為合適退火溫度。所用引物一般采用無(wú)菌水稀釋到要求的濃度，分裝到不同的EP管里，-20 ℃保存。

1.2.3DNA模板濃度的優(yōu)化:DNA模板濃度的優(yōu)化也較重要，應(yīng)盡量保證核酸純凈并控制濃度：濃度太低模板量不足，濃度太高雜質(zhì)含量也高，易影響Taq酶活性。

1.2.4PCR循環(huán)數(shù)的優(yōu)化：PCR循環(huán)數(shù)以不超過(guò)35個(gè)為宜，用以減少假陽(yáng)性擴(kuò)增的可能性。

1.2.5PCR反應(yīng)體系中一般需要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照(即以H2O為模板)、空白對(duì)照(即不加模板)。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增獲得目的條帶，而陰性及空白對(duì)照未獲得目的條帶時(shí)，基因型鑒定結(jié)果可靠，否則可能存在交叉污染。

1.3 實(shí)驗(yàn)復(fù)檢原則

實(shí)驗(yàn)復(fù)檢原則在基因型鑒定實(shí)驗(yàn)中是必需堅(jiān)持的要點(diǎn)，并且要從模型剪尾開(kāi)始，重新提取DNA，重新開(kāi)始PCR基因型鑒定。比較前后兩次鑒定結(jié)果是否吻合。如果不吻合，需要重復(fù)一次?；蛐丸b定結(jié)果要仔細(xì)標(biāo)記到對(duì)應(yīng)的動(dòng)物上，所以每只轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的唯一標(biāo)識(shí)顯得非常重要。

1.4 實(shí)驗(yàn)室DNA交叉污染預(yù)防

由于鑒定實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期重復(fù)鑒定工作，空氣中容易形成特定DNA片段的氣溶膠，易產(chǎn)生交叉污染現(xiàn)象，體現(xiàn)為PCR陰性對(duì)照中能擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，測(cè)序結(jié)果也顯示為目標(biāo)條帶[8-10]。避免這個(gè)問(wèn)題，應(yīng)該從實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)室布局、實(shí)驗(yàn)室操作等方面來(lái)預(yù)防。當(dāng)交叉污染發(fā)生時(shí)，可以采用加強(qiáng)通風(fēng)、紫外照射、特殊化學(xué)試劑處理等辦法進(jìn)行消除。

2 隨機(jī)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的基因型鑒定設(shè)計(jì)要點(diǎn)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段將外源基因?qū)氲叫∈笤缙谂咛?，并使其整合到基因組中，獲得的能穩(wěn)定遺傳該外源基因的小鼠品系稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因小鼠[11-12]。該小鼠模型的基因型鑒定比較簡(jiǎn)單，只需要在插入基因片段內(nèi)設(shè)計(jì)上下游引物即可。一般擴(kuò)增的目的片段為500 bp左右，其引物設(shè)計(jì)示意圖見(jiàn)圖1。結(jié)果的判讀：有目的條帶者為陽(yáng)性遺傳修飾動(dòng)物模型，否則為陰性，同時(shí)應(yīng)確認(rèn)陰性對(duì)照組未擴(kuò)增。

圖1 隨機(jī)轉(zhuǎn)基因小鼠模型鑒定引物設(shè)計(jì)示意圖注：紅色片段表示插入DNA片段Fig.1 Schematic diagram of primer design ofrandom transgenic mice modelNote:The red fragment represents the inserted DNA fragment

3 條件性基因敲入小鼠模型基因型鑒定設(shè)計(jì)要點(diǎn)

條件性基因敲入小鼠模型的設(shè)計(jì)原理，一般是定點(diǎn)插入在Rosa 26位點(diǎn)，在目標(biāo)基因(以PSGL1基因?yàn)槔?，圖2)前插入了loxp-stop-loxp元件，該元件能阻止啟動(dòng)子CAG 蛋白啟動(dòng)PSGL1基因的表達(dá)。要正確表達(dá)PSGL1基因，則需要與特定Cre小鼠交配，刪除lox-stop-lox元件。另外，該模型由于是條件性基因敲入，可以通過(guò)與不同帶Cre重組酶的工具鼠交配，獲得在生物體不同的細(xì)胞、組織、器官或者在不同的發(fā)育階段表達(dá)的小鼠模型。所以該類(lèi)模型的基因型鑒定需要分為兩部分介紹[13-14]。

3.1 含有目的基因但不表達(dá)的基因敲入小鼠模型的基因型鑒定設(shè)計(jì)要點(diǎn)

與Cre重組酶工具鼠交配之前的模型的基因型鑒定應(yīng)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，先在插入位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物名稱(chēng)為Rosa-GT-F與Rosa-GT-R，后在WPRE元件上設(shè)計(jì)另一對(duì)引物為WPRE-F與WPRE-R。

對(duì)其鑒定結(jié)果的判定比較復(fù)雜，需符合以下條件：兩對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增目的片段則判定為陽(yáng)性雜合小鼠；Rosa-GT-F與Rosa-GT-R這對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增，WPRE-F與WPRE-R能擴(kuò)增出片段，二者同時(shí)成立，則判定為陽(yáng)性純合小鼠；Rosa-GT-F與Rosa-GT-R這對(duì)引物能擴(kuò)增目的片段，但WPRE-F與WPRE-R無(wú)擴(kuò)增片段，則判定為野生型小鼠。具體判定結(jié)果見(jiàn)表1，對(duì)于樣本1： Rosa-GT這對(duì)引物有擴(kuò)增、WPRE這對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增，則判定為野生型。對(duì)于樣本2：Rosa-GT和WPRE這2對(duì)引物均有擴(kuò)增，則判定為雜合陽(yáng)性。對(duì)于樣本3：R Rosa-GT這對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增、WPRE這對(duì)引物有擴(kuò)增，則判定為純合陽(yáng)性。陰性水對(duì)照則沒(méi)有任何擴(kuò)增條帶。

圖2 條件性敲入模型設(shè)計(jì)原理以及基因型鑒定引物設(shè)計(jì)Fig.2 Schematic diagram of primer design of conditional knockin mice model

表1 與Cre重組酶工具鼠交配之前的模型的基因型鑒定判定Table 1 Genotype identification of mice beforemating with the Cre tool mice

3.2 與Cre小鼠交配、啟動(dòng)目的基因表達(dá)的基因敲入小鼠模型的基因型鑒定設(shè)計(jì)要點(diǎn)

與Cre重組酶工具鼠交配之后，獲得的小鼠中應(yīng)去除了lox-stop-lox原件，同時(shí)引入Cre基因。這類(lèi)模型應(yīng)分別在Cre片段、WPRE片段以及插入片段內(nèi)設(shè)計(jì)引物。

該類(lèi)鑒定結(jié)果的判定原則：三對(duì)引物均有目的片段擴(kuò)增判定為陽(yáng)性雜合子，Cre基因和WPRE這兩對(duì)引物有擴(kuò)增判定為陽(yáng)性雜合子。具體判定結(jié)果見(jiàn)表2,對(duì)于樣本1：Rosa-GT、WPRE與Cre這三對(duì)引物有擴(kuò)增、則判定為雜合陽(yáng)性。對(duì)于樣本2：WPRE與Cre這兩對(duì)引物有擴(kuò)增，Rosa-GT這對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增，則判定為純合陽(yáng)性。對(duì)于樣本3：在Cre這對(duì)引物沒(méi)有擴(kuò)增的情況下，陰性水對(duì)照則沒(méi)有任何擴(kuò)增條帶。

表2 與Cre重組酶工具鼠交配之后的模型基因型鑒定判定Table 2 Genotype identification of mice aftermating with the Cre tool mice

4 基因敲除小鼠模型基因型鑒定設(shè)計(jì)要點(diǎn)

基因敲除動(dòng)物模型從最為經(jīng)典的干細(xì)胞介導(dǎo)的同源性重組到各種DNA內(nèi)切酶系統(tǒng)，如TALEN、ZFN和CRISPR/Cas9等技術(shù)均有應(yīng)用[15-18]。由于不同方法制作的動(dòng)物模型其基因型鑒定技術(shù)方法不同，所以本文分別介紹目前應(yīng)用最多的通過(guò)干細(xì)胞同源性重組和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)兩大類(lèi)模型。

4.1 同源性重組基因敲除動(dòng)物模型基因型鑒定設(shè)計(jì)要點(diǎn)

采用干細(xì)胞打靶技術(shù)制作的敲除模型的基因型多根據(jù)同源重組原理，將帶啟動(dòng)子的Neo基因(編碼新霉素neomycin的抗性基因)插入目標(biāo)基因的外顯子中，在失活目標(biāo)基因同時(shí)會(huì)引入一個(gè)新的基因Neo。在這類(lèi)模型基因型鑒定的引物設(shè)計(jì)時(shí)，上游引物應(yīng)在Neo基因內(nèi)，下游引物應(yīng)在小鼠基因組內(nèi)，以P53基因?yàn)槔?圖3)。

圖3 基于同源重組技術(shù)的基因敲除模型的引物設(shè)計(jì)Fig.3 Primer design for gene knockout model based on homologous recombination technique

該模型的鑒定結(jié)果判定原則：純合陽(yáng)性小鼠應(yīng)該只能擴(kuò)增Neo基因中的目的片段，而雜合陽(yáng)性小鼠野生型和Neo基因這兩對(duì)引物都能擴(kuò)增。野生型小鼠因缺乏Neo基因，故無(wú)法擴(kuò)增出條帶；為了結(jié)果可靠，可以同理在插入基因另外一側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，兩對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果一致再進(jìn)行判定。具體判定結(jié)果見(jiàn)表3，對(duì)于樣本1：WT這對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增、Mut-Neo這對(duì)引物有擴(kuò)增，則判定為純合陽(yáng)性。對(duì)于樣本2：WT這對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增、Mut-Neo這對(duì)引物有擴(kuò)增，則判定為雜合陽(yáng)性。對(duì)于樣本3：WT這對(duì)引物有擴(kuò)增、Mut-Neo這對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增，則判定為野生陰性，陰性水對(duì)照則沒(méi)有任何擴(kuò)增條帶。

表3 同源重組技術(shù)基因敲除模型的基因型鑒定判定Table 3 Genotypes of knockout models usinghomologous recombination technique

4.2 CRISPR/cas9打靶基因敲除小鼠模型基因型鑒定設(shè)計(jì)要點(diǎn)

采用CRISPR/cas9技術(shù)制作的基因敲除小鼠模型，無(wú)需引入Neo基因，只需在敲除片段兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，利用敲除部分片段后變短的原理來(lái)區(qū)分野生型與敲除動(dòng)物。敲除動(dòng)物的純合子與雜合子宜采用同樣設(shè)計(jì)方法進(jìn)行基因型鑒定，純合子只有一種帶型，雜合子有兩種帶型。具體判定結(jié)果見(jiàn)表4，對(duì)于樣本1：WT這對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增、Mut這對(duì)引物有擴(kuò)增，則判定為純合陽(yáng)性。對(duì)于樣本2：WT這對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增、Mut這對(duì)引物有擴(kuò)增，則判定為雜合陽(yáng)性。對(duì)于樣本3： WT這對(duì)引物有擴(kuò)增，Mut這對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增、則判定為野生陰性，陰性水對(duì)照則沒(méi)有任何擴(kuò)增條帶。

表4 CRISPR/cas9技術(shù)基因敲除模型的基因型鑒定判定Table 4 Genotypes of knockout models usingCRISPR/cas9 technique

5 結(jié)語(yǔ)

遺傳修飾技術(shù)的發(fā)展，推動(dòng)了各類(lèi)遺傳修飾小鼠模型在物醫(yī)學(xué)研究的的步伐，幾乎所有的醫(yī)學(xué)研究都利用了動(dòng)物模型。在日常工作中，我們往往存在模型如何繁育的困擾，所以明確模型的目標(biāo)基因，對(duì)于使用小鼠模型來(lái)說(shuō)是非常重要的[19]。另外，模型研究離不開(kāi)兩個(gè)關(guān)鍵詞：基因型和表型。模型的基因型改變，才可能會(huì)導(dǎo)致小鼠某些生理過(guò)程的變化，從而進(jìn)一步推斷目標(biāo)基因的功能用以進(jìn)行生命研究?；蛐褪且?，表型是果?；蛐丸b定實(shí)驗(yàn)是成就“因果關(guān)系”的基石。如果基因型鑒定實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)差錯(cuò)，那么后續(xù)所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都將謬以千里。

本文著重介紹了基因型鑒定實(shí)驗(yàn)總體原則，并通過(guò)實(shí)例介紹了三類(lèi)常用模型的基本鑒定方法。在介紹的方法中小鼠模型的DNA提取及PCR體系制備是比較關(guān)鍵的要素，應(yīng)該引起實(shí)驗(yàn)人員的重視，綜合時(shí)間成本與成功率兩大因素，推薦用裂解液和蛋白酶K處理鼠尾后將DNA純化之后，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)加凝膠電泳方式進(jìn)行PCR鑒定，從而降低污染的概率[20-21]。另外，在獲得小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，一定要明確小鼠的設(shè)計(jì)方案，制定好明確的基因型鑒定方法后才開(kāi)始后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。作者單位目前已經(jīng)開(kāi)展了部分遺傳修飾動(dòng)物模型基因型鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的申請(qǐng)工作，且得到了相關(guān)行業(yè)的立項(xiàng)通知，希望能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)引起廣大動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)人員的重視，進(jìn)一步規(guī)范基因型鑒定技術(shù)實(shí)驗(yàn)，推動(dòng)遺傳修飾小鼠模型在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用廣度及深度。