妊娠糖尿病大鼠造模方法研究進展*

江心泳 葛 莉 龐書勤 謝 勇 賴玉婷 黃萍萍 王冠東 陳 凡

(福建中醫藥大學，福州 350122)

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)的發病率正逐年不斷攀升[1]，全球發病率高達14%[2]。GDM不僅帶來早產、巨大兒、胎兒畸形等諸多母兒的不良影響，而且也增加了母親和其子代患代謝疾病的風險[1-3]。這些不良影響，引發了科研工作者對GDM研究的高度關注[4]。因此，研發符合人GDM病因和生理病理機制特點的動物模型成為一項重要課題。由于大鼠模型在糖尿病(diabetes mellitus，DM)相關研究中的廣泛應用，參考資料豐富，并且具有孕期適中的特點，成熟期和生長期較其他實驗常用哺乳動物如犬、羊、豬和靈長類動物短，適合觀察孕期高血糖對胚胎及成熟個體的影響[5]，因此大鼠被廣泛應用于GDM模型的研究中。目前，探討GDM大鼠的造模方法主要有藥物注射誘導、飲食誘導和藥物注射聯合飲食誘導三類，但各類造模方法所用藥物和飲食劑量差別大。本文對大鼠GDM造模的文獻進行綜述，以期為以大鼠構建GDM模型的實驗研究提供新的思考。

1 藥物誘導GDM大鼠模型

1.1 鏈脲佐菌素注射誘導

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)作為一種制備糖尿病動物模型的化學誘導劑被廣泛應用于科研中[6]。其導致糖尿病的機制有兩點：一是能通過葡萄糖轉運蛋白2(glucose transporter-2, GLUT-2)被胰島β細胞吸收，誘導其DNA的分裂和甲基化，抑制DNA合成，從而破壞胰島β細胞而誘發糖尿病[7]；二是被STZ破壞的胰島細胞可作為自身抗原觸發炎癥反應，擴大胰島細胞損傷從而促使糖尿病的發生[8]。STZ是近年來動物模型實驗誘導糖尿病發生的首選藥物[9-10]。

在GDM大鼠模型構建上，STZ合適劑量的選擇是建模成功的關鍵所在。蔣靜等[11]在妊娠第6天禁食12 h后分組，一次性腹腔注射45 mg/kg和55 mg/kg STZ，以STZ注射72 h后空腹血糖≥16.7 mmol/L和尿糖 ++ 為成模標準[11]，其結果顯示45 mg/kg STZ的成模率較高為95%，死亡率為5%，轉陰率為10.52%。李佳等[12]在大鼠受孕當日禁食12 h后給三組大鼠分別注射35 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg STZ，以妊娠第4天空腹血糖>11.1 mmol/L作為成模標準，其結果顯示40 mg/kg劑量的STZ成模率最高(83.3%)，死亡率最低(16.7%)。Zabrodina等[13]對妊娠當日一次性注射20、40、50、60、80 mg/kg STZ的大鼠進行了觀察對比，結果顯示20 mg/kg STZ未能改變血糖水平，40～80 mg/kg STZ能夠使大鼠的血糖水平升高，60 mg/kg和80 mg/kg STZ誘導GDM大鼠模型的死亡率最高(90%)，50 mg/kg STZ誘導GDM大鼠的胎兒在妊娠第14天死亡率達50%，而40 mg/kg STZ在不增加胎兒死亡率的情況下，可以誘導大鼠血糖水平呈動態性增高。

1.2 四氧嘧啶注射誘導

四氧嘧啶(alloxan，ALX)是嘧啶的一種含氧衍生物，是胰島β細胞毒性劑，ALX通過產生H2O2等超氧自由基選擇性地破壞胰島β細胞[14]，使其β細胞內DNA損傷，同時通過激活ADP核糖體合成酶活性，從而使輔酶Ⅰ含量下降，兩者的共同作用使mRNA功能受損而引起細胞凋亡、減少，造成內分泌功能紊亂，糖、脂肪、蛋白質等的代謝失調而形成糖尿病[15-16]。

Aires等[17]在大鼠妊娠第8天空腹12 h后單次靜脈注射37 mg/kg ALX，并以妊娠第10天血糖水平>200 mg/dL(即11.1 mmol/L)作為成模標準判斷GDM成模，結果顯示25只大鼠中有5只成模被納入實驗，成模率為20%。稅迎春等[18]使用70 mg/kg ALX尾靜脈注射誘導GMD大鼠，注射6 d后測量空腹血糖，以血糖值14～26 mmol/L判斷為造模成功，同時行口服葡萄糖耐量試驗和確認GDM大鼠模型血糖的變化。結果顯示，同對照組相比，70 mg/kg劑量的ALX使大鼠空腹血糖值升高283.4%，且大鼠出現明顯糖耐量異常。此外，Makni等[19]對6只妊娠第2天大鼠腹腔注射120 mg/kg的ALX誘導糖尿病，并口服葡萄糖溶液防止ALX造成的致命低血糖，在妊娠第3、7、20天采尾靜脈血判斷是否符合200～300 mg/dL(即11.1～16.7 mmol/L)的糖尿病標準，結果顯示6只GDM組的大鼠血糖值均符合上述糖尿病標準。

1.3 雄激素注射誘導

女性體內糖脂代謝調控與雄激素受體(androgen receptor，AR)密切相關[20]，有研究表明雄激素水平過高的女性，可以出現糖脂代謝紊亂，胰島素抵抗以及糖尿病等疾病[21]。雄激素對糖脂代謝的調控是通過與AR結合來實現[22-23]。Puttabyatappa等[24]研究表明，在實驗環境中暴露于過量雄激素的大鼠會發生胰島素抵抗，且妊娠期動物暴露于過量睪丸激素可能造成其代謝缺陷和不良妊娠結局[25]。

Areola等[26]研究使用丙酸睪酮進行造模并正常喂養，在大鼠妊娠第14天開始每天一次皮下注射0.5 mg/kg丙酸睪酮至妊娠第19天，并在妊娠第19天口服葡萄糖耐量試驗(口服2 g/kg葡萄糖前以及口服后30、60、90、120 min分別取尾靜脈血檢測)。在處死當日禁食12 h后取血用于檢測空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)和胰島β細胞功能(homeostasis model assessment-β，HOMA-β)，結果顯示妊娠晚期母體內過量的睪酮可導致母體血糖升高，發生胰島素抵抗和胰島β細胞功能受損而引發GDM。

2 飲食誘導

2.1 高脂飲食誘導

肥胖是GDM的易患因素[27]。妊娠期對糖類和脂類的攝入增加，若此時的飲食結構中脂類含量過高，導致脂肪在肝臟組織積累，而大量脂肪在肝臟的堆積是糖尿病發病的重要因素[28]，在引起妊娠期肥胖的同時也會引發GDM。飲食結構中高熱量食物的過多攝入在引發肥胖的同時又促進了脂肪因子的分泌，而脂肪因子增多被認為是GDM發病因素之一[29]。

在高脂飲食誘發GDM的相關研究中，張馨文等[30]用含有60%脂肪熱能的高脂飼料飼喂大鼠2個月后雌雄合籠，在妊娠第1、7、14、20天測量大鼠體質量和血糖變化，以及在妊娠第20天取血并行葡萄糖耐量試驗(2 g/kg葡萄糖溶液腹腔注射后0、30、60、120 min分別取尾靜脈血檢測)，結果顯示高脂飲食飼喂的大鼠在體質量、空腹血糖、C肽水平等指標上均高于普通飲食飼喂的大鼠，并出現糖耐量異常和胰島素抵抗。Wu等[31]在大鼠妊娠后給予由40%碳水化合物、40%脂肪和20%的蛋白質構成的高脂飼料并觀察高脂飲食對大鼠空腹血糖、胰島素、口服葡萄糖耐量試驗和胰島素釋放試驗的影響，以探討高脂飲食對妊娠大鼠胰島功能的影響和機制，結果顯示在高脂飲食的影響下，大鼠體質量、空腹血糖結果均有明顯升高，而空腹胰島素水平明顯下降，且出現糖耐量下降和胰島素抵抗，提示大鼠出現GDM。

2.2 高糖飲食誘導

Burgeiro等[32]的研究表明在飼喂高糖飼料后，大鼠會出現高胰島素血癥，胰島素抵抗，高脂血癥以及糖脂代謝受損等癥狀。在高糖飲食的作用下，胰島細胞的空泡形成也隨著糖濃度的增加而增加，從而造成胰島細胞的損傷[33]。Zhang等[34]研究也證明了高蔗糖飲食會增加非糖尿病大鼠的胰腺損傷。

Zou等[35]采用含(63%果糖)的高糖飲食飼喂大鼠6周后妊娠，同時設置了未孕組給予相同飲食，觀察果糖飲食對大鼠影響，并在妊娠第14天進行口服葡萄糖耐量測試，結果顯示飼喂高果糖的妊娠大鼠出現葡萄糖耐受不良，而未孕大鼠則未出現葡萄糖耐受不良，這證明了果糖飲食會導致妊娠期大鼠的葡萄糖耐受不良從而形成GDM。Ozkan等[33]對3組妊娠期大鼠在妊娠期開始到妊娠一個月的時間內，每周5 d分別飼喂含10%、20%和30%蔗糖的水，對照組飼喂普通水，并通過檢測飲水量、體質量、血糖、胰島素水平和胰島細胞的變化分析飼喂蔗糖對母鼠和子代的影響。雖然其結果顯示各組大鼠均無糖尿病，但實驗組的血糖、胰島素水平明顯高于對照組，且隨著含糖量的增加而增加，在免疫組織化學檢查與胰高血糖素免疫反應性檢查中顯示胰島素受體和胰島細胞數量減少，這表明高糖的攝入會對母體和子代的代謝平衡造成不良影響。

2.3 高脂高糖飲食誘導

高糖和高脂被認為是誘發GDM的重要因素，高脂高糖飲食通過誘發妊娠期大鼠胰島素抵抗而形成GDM大鼠模型[36]。張婕等[37]研究發現，增加脂質與糖類的攝入，使其空腹胰島素增加的同時，誘發實驗動物出現肥胖，促使分泌較多的脂肪因子，使胰島素生物學作用顯著下降，引起了胰島素作用的靶器官對胰島素作用的敏感性降低，可誘導出胰島素抵抗。

郭燕[38]使用含33%普通飼料、33%全脂、7%蔗糖和27%水的高脂高糖飼喂大鼠6周，通過妊娠后觀察體質量、空腹血糖、妊娠第20天進行口服葡萄糖耐量測定以及妊娠第22天檢測空腹血脂、胰島素等值較對照組均明顯升高為成模標準，結果顯示高脂高糖飲食誘導的GDM大鼠相較于對照組出現了明顯的糖耐量受損和胰島素抵抗。此外，豐樹煥[39]使用由20%蔗糖、1%膽酸鈉、2.5%膽固醇、10%熟豬油及66.5%普通飼料組成的高脂高糖飼料飼喂大鼠8周后妊娠誘導GDM，結果顯示高脂高糖組合籠一周后檢測的血糖值≥6.7 mmol/L且葡萄糖耐量和血脂均高于普通飲食組，提示高脂高糖組孕鼠與人類GDM的病理狀態類似。Vanzela等[40]研究了一種高脂高糖的自助餐式飲食飼喂大鼠14周，大鼠飲水上交替使用可口可樂和瓜拉納南極洲兩種軟飲料，飼料采取由37.5%標準飼料、25%花生、25%巧克力、12.5%餅干制成的顆粒與蛋糕、威化等零食一起提供，總能量為4.41 kJ/g，該研究顯示在自助餐飲食下大鼠體質量明顯增加，糖耐量受損明顯且出現胰島素抵抗。

3 藥物聯合飲食誘導

3.1 STZ聯合高脂飲食誘導

在STZ注射誘導前用高脂飲食飼喂大鼠造模。高脂飲食帶來的體內高甘油三酯是脂肪酸利用和氧化率增加的一個來源，而脂肪酸利用和氧化會降低胰島素介導的葡萄糖作用，降低糖的利用[41]，同時高脂飲食可誘導大鼠產生肥胖、脂質代謝紊亂和產生胰島素抵抗，后期再用STZ靜脈或腹腔注射，可造成胰島β細胞凋亡或胰島β細胞功能相對缺乏，從而抑制胰島素的合成，使血糖升高[42]，二者相結合，可有效制備GDM大鼠模型。

黃長盛等[43]在菟絲子對GDM大鼠影響的研究中采用60%脂肪飲食飼喂大鼠8周并聯合35 mg/kg劑量STZ構建GDM大鼠模型。實驗采用60只大鼠進行模型制作，結果顯示在以空腹血糖≥16.7 mmol/L為成模標準的情況下，有40只GDM大鼠被納入后續實驗，成模率為66.6%。此外，Liu等[44]的研究采取高脂飲食飼喂2周后聯合腹腔注射60 mg/kg劑量STZ的方法構建GDM大鼠模型。該模型的高脂飼料由58%脂肪、25%蛋白質和17%碳水化合物構成，成模標準為STZ注射72 h后血糖高于16.67 mmol/L，結果顯示造模的40只Wistar大鼠有13只成模，成模率為32.5%。

3.2 STZ聯合高脂高糖飲食誘導

高脂高糖飼料喂養，可使大鼠體質量增加，導致肥胖。肥胖能夠進一步導致胰島素抵抗[29]，Farswan等[45]研究表明高脂高糖飲食可誘發葡萄糖耐量受損，使身體轉向脂肪和蛋白質的分解和代謝，而同時通過小劑量STZ注射可損傷部分胰島β細胞，抑制或減少胰島素的分泌[46]，二者相互作用形成高血糖。

Abdel-Reheim等[47]以包含25%蔗糖、40%牛脂、20%酪蛋白的高脂高糖飲食飼喂大鼠5周，并在妊娠第7天時聯合25 mg/kg劑量的STZ注射進行GDM大鼠的造模，結果同與先前實驗進行的高脂高糖飲食聯合20 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg STZ注射的造模情況進行對比后發現高脂高糖聯合30 mg/kg和35 mg/kg STZ的大鼠體質量急劇下降，最終死亡，而20 mg/kg STZ并未引起明顯高血糖，僅25 mg/kg STZ對大鼠的葡萄糖水平有顯著影響。此外，李詩月等[48]通過以蔗糖15%、膽固醇4%、膽酸鈉0.3%、蛋黃粉10%、豬油10%、基礎膳食60.7%為配比制作高脂高糖飼料飼喂大鼠，4周后腹腔兩次注射25 mg/kg STZ(中間間隔2 d)，2 d后大鼠可出現三多一少的癥狀，10 d后90%的大鼠血糖>16.65 mmol/L，即造模成功。湯夢雨等[49]將4種劑量的STZ(15 mg/kg、25 mg/kg、35 mg/kg、45 mg/kg)單次注射并聯合高脂高糖飼料飼喂8周以探討高脂飲食聯合STZ構建GDM大鼠的方案。其高脂飼料由40%脂肪飼料構成，包括普通繁殖鼠料54.6%、豬油16.9%、蔗糖14%、酪蛋白10.2%、預混料2.1%及麥芽糊精2.2%。以注射STZ 3 d后檢測空腹血糖值在6.67 ～16.67 mmol/L為成模標準，結果顯示25 mg/kg STZ聯合高脂飲食誘導的GDM大鼠模型成模率最高(62.5%)，死亡率最低(12.5%)。

4 成模標準

血糖是GDM診斷和檢測的最基本指標，大多數研究都以空腹血糖作為糖尿病模型成立的觀測指標，但判斷標準卻有所差異，成模指標為6.7～16.7 mmol/L[49]，如有研究[9，43]以大鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L為建模成功，而有研究[39]以大鼠空腹血糖≥6.7 mmol/L為建模成功，具體成模標準見表1。王竹等[50]研究分析468例大鼠的空腹血糖和238例大鼠的餐后血糖數據，采用標準差、極差和半寬等方式對血糖分布誤差進行評估，其結果指出大鼠的空腹血糖正常值范圍在(3.95±1.31)mmol/L之間，餐后2 h血糖正常值范圍在(5.65±1.63)mmol/L，并得出結論：當實驗組大鼠的血糖值高于對照組2個標準差以上即可判斷為血糖值升高，即空腹血糖>7.8 mmol/L或餐后2 h血糖>11.1 mmol/L時即可判斷大鼠患糖尿病。但目前文獻尚未發現針對正常孕期大鼠血糖值的大樣本研究,而成模標準對GDM模型的建立至關重要，因此實驗動物GDM建模的成模標準仍需進一步研究。

表1 不同造模方法的血糖成模標Table 1 Blood glucose modeling standards fordifferent modeling methods

5 結語

目前GDM的病因尚未完全明晰，動物實驗作為基礎研究的一種方法正廣泛應用于GDM發病機制和治療與護理研究中，并發揮著重要作用。綜上所述，GDM大鼠的造模方法多，但尚未形成公認的造模方法，雖然已有文獻針對造模方法中的不同劑量進行了探討，但缺少統一的GDM大鼠成模標準和不同造模方法間的比較，以及分析大鼠活動量對GDM發生所造成的影響。所以，在未來GDM造模方法研究中需進一步依據人GDM發生發展機制，比較不同造模方法的優劣，形成一致的GDM大鼠成模標準，增加考慮妊娠大鼠活動量因素，開發出更加適用的GDM大鼠模型。