SPF小鼠上呼吸道常見細(xì)菌的分離鑒定及攜帶率分析

魏天文 胡芹寶 宣俊文 李晨江 周小江 呂 銘 張新創(chuàng)

(蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司 甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，蘭州 730046)

《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》國家標(biāo)準(zhǔn)是按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自身所攜帶的病原微生物或條件致病和對(duì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為普通級(jí)動(dòng)物conventional(CV)animal、清潔動(dòng)物clean(CL)animal、無特定病原體動(dòng)物specific pathogen free(SPF)animal、無菌動(dòng)物 germ free(GF)animal[1]。其中，細(xì)菌檢測(cè)的采樣來源于氣管分泌物、腸內(nèi)容物兩個(gè)部位。常規(guī)檢測(cè)流程是：采樣、分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清學(xué)檢測(cè)等步驟，最終以能否檢出國家標(biāo)準(zhǔn)中需排除的病原微生物來判定是否符合相應(yīng)級(jí)別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。至于分離到的其他細(xì)菌，國家標(biāo)準(zhǔn)中未作鑒定要求，通常不再做鑒定。自2016年以來我們對(duì)本單位SPF小鼠繁殖單元進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌檢測(cè)時(shí)，除檢測(cè)國標(biāo)中要求檢測(cè)的細(xì)菌外，對(duì)小鼠上呼吸道分離到的細(xì)菌均進(jìn)行了分離鑒定和統(tǒng)計(jì)，累計(jì)檢測(cè)KM小鼠640只，NIH小鼠160只，BALB/c小鼠160只，得出了SPF小鼠的上呼吸道常見細(xì)菌及攜帶率。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF小鼠均由本所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室生產(chǎn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘)2017-0001。體質(zhì)量18～22 g。

1.2 主要試劑與儀器

鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(血平皿)、麥康凱培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基均由本所培養(yǎng)基室提供或自制；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、革蘭氏染液購自杭州濱和微生物試劑有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：浙食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20100290；Vitek 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀(法國生物梅里埃公司)；Vitek 2 compact革蘭氏陽性球菌GP鑒定卡；Vitek 2 compact革蘭氏陰性菌GN鑒定卡、生物安全柜、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱和顯微鏡。

1.3 采樣

小鼠采血樣后處死，在生物安全柜內(nèi)無菌解剖取咽、喉部氣管分泌物接種在血平皿培養(yǎng)基上，放入(37 ± 1)℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。

1.4 分離鑒定

在超凈工作臺(tái)內(nèi)肉眼觀察上述培養(yǎng)物的菌落形態(tài)，挑取單顆菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，挑取單個(gè)菌落用血平皿培養(yǎng)基分純培養(yǎng)，分純的培養(yǎng)物用麥康凱培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基及生化反應(yīng)管等傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒定。同時(shí)按照鏡檢結(jié)果分別采用Vitek 2 compact革蘭氏陽性菌GP鑒定卡、Vitek 2 compact革蘭氏陰性菌GN鑒定卡進(jìn)行全自動(dòng)生化鑒定。

2 結(jié)果

2.1 小鼠氣管分泌物檢測(cè)及菌群培養(yǎng)

對(duì)SPF小鼠氣管分泌物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)鑒定發(fā)現(xiàn)，其上呼吸道常見細(xì)菌有8種。細(xì)菌在血平皿上培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)如圖1所示，革蘭氏染色的菌體形態(tài)如圖2所示。

圖1 細(xì)菌在血平皿上培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)注：A.毗鄰顆粒鏈菌；B.松鼠葡萄球菌；C.木糖葡萄球菌；D.大腸埃希氏菌；E.陰溝腸桿菌Fig.1 The colony morphology of bacteriacultured on blood plates for 24 hoursNote: A. Granulicatella adiacens；B. Staphylococus sciuri；C. Sta.xylosus； D.Escherichia coli；E. Enterobacter cloacae

圖2 革蘭氏染色的菌體形態(tài)Fig.2 The mycelial morphology in Gram staining

2.1.1毗鄰顆粒鏈菌(Granulicatellaadiacens)：在血平皿上培養(yǎng)24 h菌落形態(tài)呈針尖大小，周邊有輕微溶血或不明顯。革蘭氏染色短鏈狀或長(zhǎng)鏈狀陽性球菌或桿菌，也有部分單個(gè)、成雙的散在排列。Vitek 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定結(jié)果提示可信度93%。

2.1.2松鼠葡萄球菌(Staphylococussciuri)：在血平皿上培養(yǎng)24 h菌落形態(tài)呈1～2 mm淡黃色菌落)，不溶血。革蘭氏染色陽性球菌，呈葡萄串狀排列。Vitek 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定結(jié)果提示可信度99%。

2.1.3木糖葡萄球菌(Sta.xylosus)：在血平皿上培養(yǎng)24 h菌落形態(tài)呈0.5～1 mm白色菌落，不溶血。革蘭氏染色陽性球菌，呈葡萄串狀排列。Vitek 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定結(jié)果提示可信度91%。

2.1.4陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)：在血平皿上培養(yǎng)24 h菌落形態(tài)呈3～4 mm大而濕潤的黏液狀菌落，不溶血。麥康凱瓊脂上為淡粉紅色菌落。革蘭氏染色陰性粗短桿菌。Vitek 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定結(jié)果提示可信度99%。

2.1.5奇異變性桿菌(Proteusmirabilis)：在血平皿上培養(yǎng)24 h菌落形態(tài)呈擴(kuò)散生長(zhǎng)或呈遷徙生長(zhǎng)，有特殊臭味。革蘭氏染色陰性桿菌。Vitek 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定結(jié)果提示可信度99%。

2.1.6大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)：在血平板上培養(yǎng)24 h菌落形態(tài)呈3～4 mm灰白色或略帶一些棕黃色菌落，不透明，菌落表面濕潤。革蘭氏染色陰性粗短桿菌。麥康凱瓊脂上為粉紅色菌落。Vitek 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定結(jié)果提示可信度96%。

2.1.7不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)：在血平板上培養(yǎng)24 h菌落形態(tài)呈2～3 mm灰白色菌落，不透明，菌落表面濕潤。麥康凱瓊脂上為無色菌落。革蘭氏染色陰性桿菌。Vitek 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定結(jié)果提示可信度94%。

2.1.8肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)：在血平板上培養(yǎng)24 h呈菌落形態(tài)3～4 mm灰白色黏液狀菌落，菌落表面濕潤。麥康凱瓊脂上為粉紅色菌落。革蘭氏染色陰性粗短桿菌。Vitek 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定結(jié)果提示可信度99%。

2.2 SPF小鼠上呼吸道常見細(xì)菌檢出數(shù)及攜帶率

檢測(cè)結(jié)果見表1所列。

表1 SPF小鼠的呼吸道常見細(xì)菌檢出數(shù)及攜帶率Table 1 The quantity and carrying rate and of commonbacteria in the respiratory tract of SPF mice

3 討論

《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的SPF小鼠必須檢測(cè)及必要時(shí)檢測(cè)項(xiàng)目共有16項(xiàng)，均為病原微生物或條件致病和對(duì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原，實(shí)際情況下SPF小鼠上呼吸道攜帶有大量的細(xì)菌，分離鑒定這類細(xì)菌并了解其攜帶率，有助于SPF小鼠群體的微生物質(zhì)量評(píng)估，也為相關(guān)科研項(xiàng)目選擇使用SPF小鼠時(shí)提供數(shù)據(jù)支持。

本研究就本單位自2016年以來對(duì)SPF小鼠繁殖單元進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌檢測(cè)時(shí)，對(duì)采集到的上呼吸道細(xì)菌均做了進(jìn)一步的鑒定，得到SPF小鼠上呼吸道常見細(xì)菌及攜帶率，從細(xì)菌攜帶率看大致可分為四類情況。第一類：毗鄰顆粒鏈菌，攜帶率高達(dá)98.6%，幾乎每只小鼠均攜帶；第二類：松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌，攜帶率45%～65%；第三類：包括陰溝腸桿菌、大腸埃希氏菌、奇異變性桿菌，攜帶率25%～45%；第四類：包括不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌等，攜帶率10%以下。按照國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不同繁殖單元的要求，群體在100～500只，采樣量不少于10只，則每次檢測(cè)前三類細(xì)菌均能檢出，攜帶率也穩(wěn)定在一個(gè)區(qū)間內(nèi)。證明這幾種細(xì)菌在小鼠上呼吸道屬于一種常態(tài)存在。

四類細(xì)菌大多為非致病菌或正常菌群，很少看到有實(shí)驗(yàn)小鼠感染這類細(xì)菌引起疾病的報(bào)到。但人有感染毗鄰顆粒鏈菌、松鼠葡萄球菌引起敗血癥的報(bào)道[1-2]；而陰溝腸桿菌更是醫(yī)院感染的重要病原菌[3]；人感染這類細(xì)菌的原因常常是病人已有基礎(chǔ)病，自身免疫力下降或菌群失調(diào)引起；奇異變性桿菌在小鼠上分離報(bào)道多與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)相關(guān)[4]；不動(dòng)桿菌廣泛分布于外界環(huán)境中，分離鑒定過程中能檢出瓊氏不動(dòng)桿菌、魯氏不動(dòng)桿菌及鮑氏不動(dòng)桿菌；大腸埃希氏菌是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌，能檢出也屬于正常。

肺炎克雷伯菌是國標(biāo)中要求SPF小鼠必須排除的細(xì)菌，從檢出結(jié)果看NIH小鼠繁殖單元、BALB/c小鼠繁殖單元均有檢出，檢出率不足3%。這個(gè)檢出率和劉麗達(dá)等[5]報(bào)道的結(jié)果相近，此菌在長(zhǎng)達(dá)幾年的檢測(cè)過程中，有時(shí)能檢出，有時(shí)檢不出，說明該菌在整個(gè)動(dòng)物群體中始終處于一種低水平攜帶狀態(tài)，并沒有因?yàn)橛袡z出而出現(xiàn)攜帶率上升的趨勢(shì)，如按照現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)只要有檢出就判定這個(gè)群體達(dá)不到SPF標(biāo)準(zhǔn)，但從另外一個(gè)角度我們認(rèn)為對(duì)于這種人和動(dòng)物呼吸道和消化道寄生性條件致病菌[6]，是否可以用一種定量的標(biāo)準(zhǔn)，如以攜帶率為限定，用來判定動(dòng)物群體是否符合標(biāo)準(zhǔn)更客觀一些？

分離培養(yǎng)、生化鑒定是細(xì)菌檢測(cè)的經(jīng)典方法，雖然受各種因素的制約，靈敏度受影響，但檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性使此方法一直都在沿用。這幾年來只是常規(guī)檢測(cè)，沒有涉及到微需氧菌和厭氧菌的培養(yǎng)，因此得到的結(jié)果均為需氧菌并且只限于上呼吸道。作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位，在提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證的同時(shí)若能再附一份全方位的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常見細(xì)菌及攜帶率等相關(guān)信息，將更有助于為SPF小鼠群體的微生物質(zhì)量評(píng)估及相關(guān)科研項(xiàng)目選擇使用SPF小鼠時(shí)提供支持，這些工作有待于以后逐步完善。