自發性先天性白內障大鼠皮膚移植及生化位點的研究*

尤金煒 董 敏 吳正林 梁 磊 田小蕓

(東部戰區總醫院醫療保障中心實驗動物室，南京 210002)

本單位于2007年在屏障環境SD大鼠生產的仔鼠中發現5只先天性白內障大鼠，3只雄性，2只雌性。以此大鼠為基代，培育近交系大鼠，經過10多年的連續近交繁殖，現已培育至第31代，暫定名為TSC大鼠，理論上已經達到基因高度純合，符合近交系動物的近親繁殖代數要求。我們已經對TSC大鼠各生理指標做了相應的檢測與分析，包括：晶狀體的病理學研究、繁殖性能及生長發育試驗、生化及血流變學指標、臟器質量及系數以及血壓與體溫基礎數據分析[1-6]，為了觀察 TSC大鼠的基因純合度和遺傳穩定性，根據國家標準[7]我們對其進行了背-背皮膚移植實驗以及酯酶-1、酯酶-3等11個生化標記基因的測定。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

皮膚移植實驗：TSC大鼠10只，6～8周齡，體質量170～200 g，雄性。

生化標記位點檢測：TSC大鼠6只，6～8周齡，體質量200～220 g，雌雄各半，選自基礎群F29代的同一窩群。

所有動物均由本實驗室提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(軍)2017-0018，動物均在SPF級設施飼養，實驗動物許可證號：SYXK(軍)2017-0037，并按使用的3R原則給予人道的關懷。其他對照品系購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：電泳儀為Bio-Rad Model 3000Xi，醋酸纖維膜和醋酸纖維板為浙江臺州生產；手術器材一套。

試劑：Tris(Sigma)、HCl(上海久憶化學試劑有限公司)等均為國產分析純；0.9%生理鹽水(浙江濟民制藥股份有限公司)；青霉素G鈉粉80萬單位(山東魯抗醫藥股份有限公司)；0.7%戊巴比妥鈉溶液(南京安培化工科技有限公司)；5%聚維酮碘溶液(東部戰區總醫院)。

1.3 方法

1.3.1皮膚移植實驗：0.7%戊巴比妥鈉溶液按1 mL/200 g腹腔注射麻醉大鼠，大鼠背部朝上固定，背部左右各剃毛一塊，左側用于自體皮膚移植，右側用于異體皮膚移植；5%聚維酮碘溶液消毒，取皮約8～10 mm，放入裝有生理鹽水的平皿中，除去真皮以外的筋膜和脂肪等，第1只鼠先行自體皮膚移植，后取右側用于異體移植，移植順序按1號鼠移植給2號鼠，2號鼠移植給3號鼠，以此類推，10號鼠移植給1號鼠，每片皮片均逆毛移植。用結節縫合法將皮片縫合4針，5%聚維酮碘溶液消毒，10%青霉素鈉溶液抗菌，貼上創可貼后壓上消毒紗布并固定，見圖1～圖3，術后單籠飼養并記錄。

圖1 白內障大鼠的異體皮片縫合Fig.1 Suture of allogenric skin graft in cataract rats

圖2 創可貼貼于白內障大鼠的手術創面Fig.2 A band-aid applied to the surgicalwound of cataract rats

圖3 紗布貼壓于白內障大鼠移植皮片上Fig.3 Gauze was applied to the skin graft of cataract rats

1.3.2生化標記位點檢測：制備血漿及溶血素，以抗凝毛細管行眼眶采血術，500×g、5 min，分離血漿和血球，吸出血漿備用。在去除血漿的富含紅血球的試管內加入4份蒸餾水，振蕩1 min，成為紅色透明液體即為溶血素。

組織勻漿上清液：采用安死術處死動物，剖腹，取腎臟1個，小腸6～8 cm，睪丸1個，肺臟1葉。分別加入2份適量預冷蒸餾水，組織勻漿器勻漿。勻漿液置4 ℃低溫高速離心機中，2 000×g、30 min，吸取上清液備用。

電泳樣品的制備、電泳步驟、染色等都按GB/T 14927.1—2008實驗動物近交系小、大鼠生化標記檢測法的規定進行操作。

2 結果

2.1 皮膚移植實驗

1周后拆除包扎，觀察皮片成活情況，若發現皮片干癟、脫落則為手術失敗。如皮片脫痂，手術部位平整、且10 d后長出新毛視為手術成功。本次實驗的10只皮膚移植大鼠均移植成活，見圖4～圖5。

圖4 白內障大鼠100 d后自體移植皮片生長情況Fig.4 Growth of autologous skin graft incataract rats after 100 days

圖5 白內障大鼠100 d后異體移植皮片的生長情況Fig.5 Growth of allografts skin graft incataract rats after 100 days

2.2 生化標記位點檢測

按照中華人民共和國國家標準GB/14923—2010 實驗動物 哺乳類實驗動物的遺傳質量控制、GB/T 14927.1—2008實驗動物近交系小、大鼠生化標記檢測法測定，TSC大鼠的11個生化標記基因呈單一型的純合子，未見到雜合子，檢測結果見表1所列。中國食品藥品檢定研究院報告編號：DH201906614R。

表1 TSC大鼠生化標記基因檢測結果Table 1 Detection results of biochemicalmarker genes in TSC rats

3 討論

近交系動物是指同胞兄妹連續交配20代以上而培育出來的遺傳上具有高度純合性和穩定性的純品系動物[7]。近交系動物基因高度純合與一致、實驗結果精確度高且極易重復，具有可比性，對各種應激反應均一，遺傳背景明確，現已被廣泛應用于生命科學研究各個方面。大鼠是比較常用的實驗動物之一，尤其在生理學、藥理學、毒理學和腫瘤學等研究領域。相比近交系小鼠的培育，近交系大鼠培育需要的費用較高，且時間也比較長，目前國內培育近交系大鼠的較少，已知的近交系大鼠有200多種，常用的大約有150多種[8]。

本單位于2007年以5只先天性白內障大鼠為基代，培育近交系大鼠，經過10多年的連續近交繁殖，現已培育至第31代，暫定名為TSC，該大鼠繁殖力正常，晶狀體外觀以及組織形態學改變均符合白內障病理改變。人類先天性白內障的病因比較復雜，病理機制不完全清楚，且能夠跟蹤研究的樣本較少，此模型大鼠有可能在研究人類發病機制、尋找藥物靶點等醫學研究方面成為一種有價值的動物模型。大量的研究結果已經證明，近交系動物基因高度純合，免疫源性高度一致，其同種(系)異體皮膚移植不會發生免疫排斥反應；皮膚移植是近交系動物遺傳監測的指標之一。皮膚移植有背-背法移植，尾-尾法移植，耳-背法和尾-背法等方法。本文采用背-背法全厚皮片對自行培育的先天性白內障近交系大鼠進行自體和異體皮膚移植實驗，以觀察皮片的成活情況。同種(系)異體皮膚移植實驗是利用免疫系統能夠識別“自己”與“異體”的特性來鑒定組織相容性基因是否一致的重要手段[9-11]，同種(系)異體移植成功說明同種(系)異體的組織相容性一致。本實驗采用的白內障大鼠自體和異體皮膚移植均成活100 d及以上，未發生排拆反應，說明自我培育的白內障大鼠的組織相容性是一致的。

生化標記基因位點的測定結果顯示，酯酶-1等11個生化標記位點均為純合型，符合國家近交系質量標準規定，參照目前常用的近交系大鼠品系的生化遺傳概貌，未發現與TSC大鼠的生化標記基因位點完全相同的，TSC大鼠具有獨特的遺傳特征，所測定的遺傳概貌可作為該品系大鼠今后遺傳質量監測的判定指標。

現代生物技術的高速發展，檢測手段和檢測儀器的不斷更新，實驗動物的遺傳質量監測已經不局限于傳統的生化標記檢測、皮膚移植法、毛色基因測試以及下頜骨測量法了[12]。分子生物學技術被廣泛的運用到檢測中，微衛星標記、SNP標記等DNA標記方法越來越普遍的被用于實驗動物的遺傳質量檢測，其優點是操作簡便，重復性好，且僅需要提取少量血液樣本即可實現實驗動物的遺傳質量檢測，無需安樂死實驗動物，符合動物福利和3R原則，主要應用于近交系動物的遺傳分析，但尚未形成標準[13]。皮膚移植法和生化標記檢測法自上世紀90年代開始使用至今，在實驗動物遺傳質量控制方面發揮著至關重要的作用。