七甲川菁染料與醋酸阿比特龍的化合物應(yīng)用于小鼠前列腺癌的活體成像和治療研究*

譚鄧旭 馬帥軍 吳朋朋 張彩勤 趙 勇 白 冰 秦 靖 師長宏

(空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，全球發(fā)病率僅次于肺癌排名第二[1-3]。在北京、上海、廣州等經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，前列腺癌發(fā)病率已躍居男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位[4]。初診前列腺癌患者大多屬于激素依賴性，隨著雄激素剝奪治療和病程進(jìn)展，幾乎都會(huì)發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌[5]。盡管在篩查和治療局部疾病方面取得了進(jìn)展，但晚期前列腺癌仍然無法治愈。手術(shù)或化學(xué)去勢等策略在過去60多年一直是前列腺最有效治療方法[6]，但近幾年的研究表明，前列腺癌可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)分泌雄激素，通過AR基因突變和/或擴(kuò)增的類固醇水平可支持腫瘤的持續(xù)生長[7-8]。實(shí)際上，去勢抵抗性前列腺癌患者在現(xiàn)有治療方案中預(yù)后是有限的，因此迫切需要研發(fā)創(chuàng)新藥物。

雄激素受體阻滯劑在前列腺癌治療中表現(xiàn)出的效果[9-11]吸引科學(xué)家對新療法產(chǎn)生濃厚興趣，目前在臨床前和臨床研究都集中開發(fā)有效的抗雄藥物。抗雄激素藥CYP17抑制劑——醋酸阿比特龍(abiraterone acetate，ABi)在不同階段均具有抗雄激素作用，并在臨床試驗(yàn)中取得了不錯(cuò)的療效[12-15]。臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，醋酸阿比特龍能夠顯著下調(diào)患者tPSA、睪酮水平，改善患者前列腺功能，緩解病情進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，七甲川菁近紅外熒光染料(IR-783和DZ-1)在肝癌、胃癌等腫瘤的PDX模型中有很好的腫瘤靶向性[16-20]，因此，本研究設(shè)計(jì)將七甲川菁近紅外熒光染料DZ-1和IR-783分別與醋酸阿比特龍進(jìn)行共軛連接，研究其化合物在前列腺腫瘤的治療及其在小動(dòng)物活體成像中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境：5～6周齡SPF級雄性裸鼠30只，體質(zhì)量22～25 g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0010。飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)教研保障中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室SPF級屏障設(shè)施中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(陜)2018-001。環(huán)境溫度23～25 ℃，相對濕度40%，12 h/12 h晝夜交替，飼喂江蘇協(xié)同生物無菌飼料，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理，動(dòng)物自由攝食和飲水。

1.1.2倫理審查及腫瘤標(biāo)本：本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利及倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)：19027。前列腺癌腫瘤標(biāo)本(編號(hào)：B45354)來自空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，腫瘤標(biāo)本的獲取經(jīng)過患者本人及家屬同意，并簽署知情同意書，僅供實(shí)驗(yàn)研究。人體標(biāo)本實(shí)驗(yàn)通過西京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào)：2016317)。

1.1.3試劑及藥物：Caliper Lumina Ⅱ小動(dòng)物光學(xué)成像系統(tǒng)(Caliper)；高效液相-電噴霧-離子井/飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(shimadzu)；UV-1900(島津國際貿(mào)易有限公司)；熒光分光光度計(jì)FL8500(PerkinElmer)。

醋酸阿比特龍(Johnson & Johnson)；DZ1-ABi、783-ABi(北京泛博生物化學(xué)有限公司化學(xué)合成)；異氟烷麻醉劑(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)基(Thermo Fisher)；PC-3、 C4-2及LNcaP(ATCC)。

1.2 方法

1.2.1化合物合成:委托北京泛博生物化學(xué)有限公司在冰水浴氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下加入飽和氫氧化鋰(36.64 mg，1.53 mmol，F(xiàn)W=23.95)，室溫反應(yīng)24 h鹽酸調(diào)節(jié)pH 2～3析出醋酸阿比特龍，對七甲川菁染料和醋酸阿比特龍?jiān)诓煌稽c(diǎn)進(jìn)行連接，其產(chǎn)物分別為DZ1-ABi和783-ABi。使用高分辨率質(zhì)譜對兩種產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征檢測，使用紫外分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)檢測兩種新合成化合物紫外吸收光譜以及熒光光譜。

1.2.2MTT檢測藥物作用后細(xì)胞增殖抑制率:在37 ℃、5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中，在10%胎牛的RPMI-1640加入青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞PC-3、 C4-2、LNcaP。收集對數(shù)期細(xì)胞鋪板96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 000個(gè)/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)，孵育至細(xì)胞貼于孔底(96孔平底板)。用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至不同的濃度(160 μmol/L、80 μmol/L、40 μmol/L、20 μmol/L、10 μmol/L、0 μmol/L)，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)重復(fù)孔， 100 μL/孔，孵育72 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結(jié)束，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150 μL/孔，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD450 nm處測量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及藥物治療:將人前列腺癌PDX(B45354)皮下移植裸鼠，待瘤組織長至90～120 mm3時(shí)，隨機(jī)分為4組(n=5)：對照組(control)、ABi組、DZ1-ABi組以及783-ABi組，參考ABi的給藥方式和劑量[15]，三種藥物均按照0.15 mmol/kg灌胃，1次/d，連續(xù)30 d。利用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積，每5天測量一次，分別測量皮下腫瘤的長度(l)和寬度(w)，腫瘤體積(V)，計(jì)算公式為：V=1/2×(w2×l)。

1.2.4活體成像監(jiān)測DZ1-ABi和783-ABi體內(nèi)代謝分布狀況：將前列腺癌細(xì)胞PC-3(1×106個(gè)/只)皮下移植裸鼠，待腫瘤生長至300～500 mm3分別注射DZ1-ABi和783-ABi(0.1 nmol/只)，通過Caliper Lumina Ⅱ小動(dòng)物光學(xué)成像系統(tǒng)分別監(jiān)測2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，7個(gè)時(shí)間點(diǎn)染料在小鼠體內(nèi)代謝情況，觀測腫瘤部位近紅外熒光面積和強(qiáng)度(激發(fā)/發(fā)射：745 nm/ICG)。

2 結(jié)果

2.1 化合物的合成與表征

DZ1-ABi和783ABi合成路徑如圖1A所示。我們分別對新和成兩種化合物DZ1-ABi(FM=1 067.8)和783-ABi(FM=1 127.61)進(jìn)行了質(zhì)譜檢測(圖1B)，證實(shí)該化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)。在PBS、5%FBS和DMSO不同溶劑分別測定DZ1-ABi(100 μmol/L)和783-ABi(100 μmol/L)光學(xué)特征(圖1C)，結(jié)果顯示，兩種化合物在不同溶劑中的吸收峰均在780～800 nm，但是兩種化合物在不同溶劑紫外吸收峰值不同，且在同一介質(zhì)中，DZ1-ABi明顯高于783-ABi。兩種化合物溶解于PBS(100 μmol/L)進(jìn)行熒光檢測發(fā)現(xiàn)DZ1-ABi發(fā)射峰值在836 nm，783-ABi僅在813 nm，且同一濃度DZ1-ABi熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于783-ABi，我們將兩種染料放置在EP管內(nèi)用活體成像設(shè)備驗(yàn)證了這一結(jié)果(圖1D)。

圖1 DZ1-ABi和783-ABi化合物的合成及其表征檢測Fig.1 Synthesis, characterization and detection of DZ1-ABi and 783-ABi compounds

2.2 MTT檢測藥物作用細(xì)胞增殖抑制率

結(jié)果如圖2所示。通過MTT法檢測結(jié)果表明：抑制腫瘤細(xì)胞增殖對藥物劑量有一定依賴性，并且發(fā)現(xiàn)藥物濃度在20～40 μmol/L時(shí)DZ1-ABi 表現(xiàn)出明顯的腫瘤抑制作用，抑制效果顯著優(yōu)于783-ABi和ABi。

2.3 藥物療效評價(jià)

三種化合物的療效通過抑制腫瘤的體積大小進(jìn)行評估，結(jié)果顯示三種藥物相較于對照組都有明顯的腫瘤治療效果，但DZ1-ABi治療組結(jié)果揭示更為顯著的腫瘤抑制作用(圖2D)。

2.4 動(dòng)態(tài)監(jiān)測化合物染料的代謝分布

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DZ1-ABi從4 h后開始在腫瘤上聚集，隨著時(shí)間推移皮下腫瘤部位的熒光特異性逐漸增強(qiáng)，783-ABi始終未能表現(xiàn)腫瘤的特異靶向性，并且在熒光強(qiáng)度上，DZ1-ABi也遠(yuǎn)高于783-ABi(圖3A)。利用ROI計(jì)算藥物代謝24 h內(nèi)單位面積腫瘤的熒光強(qiáng)度，DZ1-ABi和783-ABi在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P<0.01)(圖3B)。

圖2 三種化合藥物在細(xì)胞模型和PDX模型中的療效評價(jià)注：A.三種化合物對腫瘤細(xì)胞PC-3的作用；B. 三種化合物對腫瘤細(xì)胞C4-2的作用；C. 三種化合物對腫瘤細(xì)胞LNcaP的作用；D. 三種藥物抑制PDX(B45354)腫瘤的體積變化Fig.2 Evaluation of the efficacy of three chemical compounds in cell model and PDX modelNote：A. The effect of the 3 compounds on the PC-3 cell; B. The effect of the 3 compounds on C4-2 cell;C. The effect of the 3 compounds on LNcaP cell; D. Three compounds inhibit the volume change of PDX (B45354) tumor

圖3 DZ1-ABi和783-ABi在小動(dòng)物活體成像檢測結(jié)果注：A.DZ1-ABi和783-ABi在前列腺癌PDX皮下模型中的活體成像；B. 化合物代謝24 h后DZ1-ABi和783-ABi在單位面積的熒光強(qiáng)度對比Fig.3 DZ1-ABi and 783-ABi in the live imagingNote: A. Living imaging results of DZ1-ABi and 783-ABi on PDX subcutaneous model of prostate cancer;B. Comparison of fluorescence intensity per unit area of DZ1-ABi and 783-ABi after 24 hours of compound metabolism

3 討論

根治性前列腺切除仍然是治療前列腺最有效的手段，但在高風(fēng)險(xiǎn)或轉(zhuǎn)移性患者中優(yōu)先考慮放射療法、化學(xué)療法和雄激素剝奪療法[21-24]。近年來，越來越多的研究集中在開發(fā)新型多功能藥物上，這些藥物可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)癌癥診斷和個(gè)性化治療[25]。醋酸阿比特龍是一種CYP17抑制劑，可改善接受或不接受多西他賽治療的前列腺癌患者的總體生存率[26]。除可以抑制CYP17外，醋酸阿比特龍也是雄激素受體的拮抗劑，可以抑制3β-羥基類固醇脫氫酶[27-28]，對表達(dá)高水平雄激素受體并合成自身雄激素的前列腺癌有抗腫瘤作用[29]。

本研究將醋酸阿比特龍和七甲川菁近紅外熒光染料在不同位點(diǎn)進(jìn)行連接獲得兩種化合物DZ1-ABi和783-ABi，使用高分辨率質(zhì)譜和紫外分光光度計(jì)對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征檢測，證實(shí)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性且具有熒光屬性。MTT結(jié)果顯示，DZ1-ABi對腫瘤細(xì)胞的抑制作用顯著優(yōu)于783-ABi和ABi。為了證實(shí)DZ1-ABi的腫瘤抑制效果，我們在動(dòng)物體內(nèi)選擇更具有異質(zhì)性并且更接近臨床樣本的前列腺PDX模型(B45354)進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)。結(jié)果同體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DZ1-ABi化合物在前列腺癌治療中的潛力。小動(dòng)物活體成像檢測結(jié)果更清楚地研究新合成的兩種具有近紅外熒光屬性化合物的體內(nèi)代謝和分布情況，我們設(shè)計(jì)了給藥2～72 h的連續(xù)活體成像監(jiān)測，DZ1-ABi從4 h開始在腫瘤部位的特異性富集可持續(xù)至72 h，其對前列腺癌成像的高特異性在前列腺癌患者的早期診斷、轉(zhuǎn)移灶篩查等具有一定的臨床應(yīng)用前景。

化合物在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出不同位點(diǎn)的鏈接，其化學(xué)光學(xué)特性不盡相同，因此通過以上研究，不論是在體外細(xì)胞水平還是體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，DZ1-ABi均表現(xiàn)出顯著的抑制腫瘤的優(yōu)勢，同時(shí)兼具了七甲川菁近紅外熒光染料的成像診斷功能和醋酸阿比特龍的治療作用，是具有前列腺癌成像和治療雙重功能的新型藥物，且顯示出作為理想的化療藥物可同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤診斷成像的巨大潛力。本實(shí)驗(yàn)室將通過更多的前列腺癌PDX模型進(jìn)一步驗(yàn)證研究DZ1-ABi的診斷和治療效果。