帕金森病患者血清中miRNA-153和miRNA-223的表達研究

單巖東，曾曉云，羅志秀，伍俊伊，周 潔，毛正盛

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的神經系統退行性疾病，其發病率隨年齡增長而增加，在65歲以上人群中的發病率可達2%[1]。PD的病理特征是中腦黑質致密部多巴胺能神經元的選擇性變性丟失[2]，其癥狀包括典型的運動癥狀(震顫、強直、姿勢步態異常和運動遲緩)和非運動癥狀(嗅覺減退、睡眠障礙、感覺異常等)。有研究估算了過去的25 y間PD的診斷準確率，為80%[3]。但是有研究指出，在PD的早期階段(H-Y分級1級)，PD病程在5 y內的診斷準確率為53%，而病程在3 y內的診斷準確率僅為26%[4]。目前，PD的診斷主要依賴于臨床醫師對其臨床癥狀和體征的評估，而缺乏敏感性和特異性都較好的臨床診斷標記物。

目前認為PD是遺傳易感性與環境因素相互作用的結果，其中遺傳因素對PD的發病起著重要作用。MicroRNA(miRNA)是一種非蛋白質編碼RNA，在正常和疾病狀態的各個過程中均具有重要的調節作用[5]。由于miRNA在疾病進展中的異常表達，因此 miRNA可以作為診斷PD以及其他疾病的生物標記物[6，7]。多個研究證實了miRNA-153和miRNA-223與PD病理改變之間的密切聯系[8～10]。本研究將定量檢測miRNA-153和miRNA-223在PD患者血清中的表達，評價其診斷PD的效能，以期為PD的診斷提供生物學標志物。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2018年1月至2019年6月在武漢市第四醫院住院的PD患者35例為研究對象(PD組)，其中男性16例，女性19例，平均年齡(65.12±10.37)歲。另選取同期本院體檢中心的健康體檢者40例為對照組，其中男性18例，女性22例，平均年齡(63.71±9.89)歲。兩組受試者的年齡、性別無統計學差異(P>0.05)。所有受試者簽署知情同意書，本研究經我院倫理委員會審核批準。

1.2 PD納入標準 由兩名神經科醫生根據英國PD腦庫的診斷標準診斷為原發性PD。

1.3 PD排除標準 ①繼發性PD；②帕金森綜合征；③PD陽性家族史者；④患有腦血管疾病及其他全身系統嚴重疾病者。

1.4 收集血清樣本 抽取PD患者和健康體檢者的空腹肘靜脈血5 ml，置入含EDTA-K2抗凝劑的真空采血管中，靜置30 min，然后放入離心機，3000轉10 min，取上清液置于離心管中，放入-80 ℃冰箱保存。

1.5 RNA的提取及逆轉錄 按照血清RNA提取試劑盒(北京天根公司)說明書操作提取血清標本中的總RNA，后用紫外分光光度計檢測吸光度值，選取比值在1.8～2.0的RNA樣本，放入-80℃冰箱。將上述RNA樣本采用逆轉錄試劑盒(Revertra Ace qRT-PCR Master Mix)逆轉錄為cDNA，置入-80 ℃備用。

1.6 實時定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-153和miR-223的表達 根據GenBank中的基因序列號，用Primer Primer 5.0軟件設計引物(上海生工合成)，U6作為內參。miR-153的上游引物序列：5’-TCAATGCCTATCAATTATGC-3’，下游引物序列：5’-CTAACGTACGATTCCATAGG-3’；miR-223的上游引物序列：5’-ATTCTGTACCGTATCGGCC-3’，下游引物序列：5’-TACCGGTACTATCCTAGAA-3’；U6的上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。PCR反應在ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進行，程序為：95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，共40個循環。實驗所得數據運用公式2-ΔΔCt進行分析。

2 結 果

2.1 miRNA-153和miRNA-223在PD組和健康對照組血清中的表達 本研究中，PD組血清中miRNA-153的相對表達水平(1.87±0.64)明顯低于對照組(2.76±0.71)，差異有統計學意義(t=5.71；P<0.01)(見圖1A)；PD組血清miRNA-223的相對表達水平(1.62±0.64)與健康對照組(2.72±0.89)相比，也明顯下降，差異有統計學意義(t=6.07；P<0.01)(見圖1B)。

A B

2.2 血清miRNA-153、miRNA-223和miRNA153+miRNA-223對PD的診斷價值 根據ROC分析所示，血清miRNA-153作為診斷PD的AUC為0.8279，其敏感性和特異性分別為72.65%和81.24%；miRNA-223作為診斷PD的AUC為0.8404，敏感性和特異性分別為75.03%和77.14%；血清miRNA-153+miRNA-223作為診斷PD的AUC為0.8589，敏感性和特異性分別為77.34%和82.51%。血清miRNA-153和miRNA-223單獨診斷PD的AUC的差異無統計學意義(P>0.05)；血清miRNA-153+miRNA-223聯合檢測與分別單獨應用血清miRNA-153、miRNA-223診斷PD的AUC相比，差異無統計學意義，(P>0.05)(見表1、圖2)。

圖2 血清miRNA-153、miRNA-223以及miRNA-153+miRNA-223診斷PD的ROC

表1 血清miRNA-153和miRNA-223的診斷價值分析

2.3 PD組血清miRNA-153、miRNA-223的相對表達與H-Y分級的相關性分析 根據分析所示，PD組血清miRNA-153的相對表達(1.87±0.64)與H-Y分級(3.07±0.99)呈負相關(r=-0.4504，P<0.01)；PD組血清miRNA-223的相對表達(1.62±0.64)與H-Y分級(3.07±0.99)無明顯相關性(r=-0.2289，P>0.1)(見圖3)。

圖3 PD組血清miRNA-153、miRNA-223相對表達水平與H-Y分級相關性分析的散點圖

3 討 論

PD是一種慢性、進展性的神經系統變性疾病，目前尚無法治愈。明確診斷是PD在臨床方面的一大難題，尤其是在疾病的早期階段。因此臨床急需準確可靠的PD診斷臨床標記物。PD的病理特征是中腦黑質致密部和紋狀體中的多巴胺能神經元進行性退化，并形成纖維狀內含物：路易體和路易神經突。α-突觸核蛋白是路易體和路易神經突含有的一種重要物質，其大小為14 kDa，多位于突觸前末端和核膜中，主要作用為參與N-乙基馬來酰亞胺敏感因子受體介導的胞吐作用和突觸小泡的轉運[11]。基因或環境的改變極易引起α-突觸核蛋白發生錯誤折疊，蛋白質出現寡聚體，纖維性蛋白質逐漸增多，可溶性改變，繼而路易小體出現，最終導致多巴胺能神經元受損。多項研究發現miRNA-153和miRNA-223通過調控α-突觸核蛋白，進而與PD的發病及疾病的進展產生密切聯系[8，9]。Annamaria等的研究發現[10]，PD患者的血清miRNA-223表達明顯下調。也有團隊對PD患者腦脊液miRNA-153的表達進行了研究，發現腦脊液miRNA-153的表達明顯上調[12]；而在另一項研究中，PD患者血清miRNA-153的表達明顯下調[13]。Marisa等對PD患者唾液中miRNA-153和miRNA-223的表達進行了研究，發現miRNA-153和miRNA-223的表達均明顯下調[14]。我們的研究發現，與健康對照人群相比，PD患者血清miRNA-153和miRNA-223的表達均明顯下調；血清miRNA-153和miRNA-223作為診斷PD的AUC分別為0.8279和0.8404，而且敏感性和特異性均良好，因此可作為診斷PD的生物學標記物。血清miRNA-153和miRNA-223單獨診斷PD的價值無明顯差異；而且血清miRNA-153聯合miRNA-223診斷PD的價值無明顯提升。

本研究還分析了PD患者血清miRNA-153和miRNA-223的相對表達與PD患者H-Y分級的相關性。我們發現，PD患者血清miRNA-153的相對表達與H-Y分級之間具有明顯的相關性，呈負相關；而PD患者血清miRNA-223的相對表達與H-Y分級無相關性。因此，血清miRNA-153的相對表達有可能成為評價PD病程進展的一項指標。

綜上所述，PD患者血清miRNA-153和miRNA-223的相對表達均明顯下調，可作為診斷PD的生物學標志物；PD患者血清miRNA-153與H-Y分級呈負相關，可用于評估PD的病程進展情況。但是，本研究還存在著很多局限性：樣本量較少；對照組為健康人群，進一步的臨床應用尚需納入與其他神經系統疾病(非PD所致的運動障礙性疾病和變性疾病)；血清miRNA-153的表達是否能準確評價PD的病程進展等。這都需要進一步的深入研究。