碘佛醇可逆性影響大鼠血腦屏障通透性的形態(tài)學(xué)機(jī)制

王何瑩，堅(jiān)雅婷，趙莉莉，李 濤，張益恒，黨美娟，李 也，張 磊，向 莉，劉璟潔，張桂蓮

血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)與血液之間有效的隔絕屏障，存在于所有 CNS 發(fā)育良好的生物體內(nèi)[1，2]。BBB 主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cell，BMEC)、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突(astrocyte end-feet)、周細(xì)胞(pericytes，PCs)、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接(tight junctions，TJs)和基膜共同組成[3～5]。其中，TJs由跨膜蛋白、胞質(zhì)附著蛋白和細(xì)胞骨架蛋白共同構(gòu)成，在維持 BBB 的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定中發(fā)揮著主要功能[2，6]。BBB各結(jié)構(gòu)組成之間相互作用，構(gòu)成神經(jīng)血管單元(neurovascular unit，NVU)，有效抑制血管內(nèi)物質(zhì)的外滲，并在血液和腦之間運(yùn)輸各種必需的營養(yǎng)物質(zhì)，以維持CNS微環(huán)境的動態(tài)平衡[7]。

許多病理狀態(tài)可引起 BBB 的功能紊亂，包括創(chuàng)傷、缺氧、感染、凝血系統(tǒng)激活、炎癥、環(huán)境毒素和遺傳因素等，BBB被視為多個 CNS 疾病發(fā)生機(jī)制的中心參與者[8]。研究表明，造影劑腦病(contrast-induced encephalopathy，CIE)作為一種少見的造影劑應(yīng)用并發(fā)癥，其發(fā)生與BBB破壞密不可分[9～12]，TJs 的破壞可能是其中主要原因[13]。我們的前期研究表明，大鼠頸動脈注射碘佛醇可引起腦內(nèi)TJs相關(guān)蛋白 ZO-1 及occludin 表達(dá)變化[14]，而造影劑對BBB超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)影響目前尚未見報(bào)道。為此，本研究擬采用頸動脈注射碘佛醇建造腦損害大鼠模型，觀察注射碘佛醇后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠BBB的超微結(jié)構(gòu)變化，從形態(tài)學(xué)上探索CIE的發(fā)生機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD健康雄性大鼠，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，12～16周齡，體重240～280 g。安靜環(huán)境飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對濕度40%～70%，給予專用飼料，自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 碘佛醇(碘濃度320 mg/ml，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，伊文思蘭(Evans blue，EB)(Sigma公司)，Epon812包埋劑，鋨酸，醋酸鈾，檸檬酸鉛，丙酮，50%戊二醛。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 SD大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為正常對照組、碘佛醇組和生理鹽水組，根據(jù)給藥后不同時(shí)間的選取，后兩組再各自均分為給藥后0.5 h、3 h、6 h和24 h四個亞組。術(shù)前禁食12 h，禁水6 h。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.4 ml/kg)麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺，常規(guī)備皮消毒，取頸正中旁2 mm處行長約2 cm的縱行切口，鈍性分離皮下組織，暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)。結(jié)扎ECA，近心端夾閉CCA，于ICA分叉處下方行CCA插管，方向朝向遠(yuǎn)心端。所用導(dǎo)管為聚乙烯材料制成的一種特定插管，另一端通過一個三通閥與裝滿肝素，以及用于給藥的注射器相連。2 ml碘佛醇從CCA插管內(nèi)注射，注射過程中嚴(yán)密觀察大鼠的生命狀態(tài)。生理鹽水組給予等量的生理鹽水，而正常對照組大鼠不予手術(shù)處理。藥物注射完畢后清理切口，縫皮。將大鼠側(cè)臥位置于安靜環(huán)境下待蘇醒，注意觀察其生命體征。

1.4 伊文思藍(lán)染色 本實(shí)驗(yàn)采用伊文思藍(lán)作為BBB完整性的示蹤劑，評估大鼠頸動脈注射碘佛醇后BBB通透性的變化程度。大鼠經(jīng)尾靜脈按4 ml/kg的劑量注入2%伊文思藍(lán)溶液。成功注射EB的大鼠，可觀察到其四肢、口齒、耳朵、眼球結(jié)膜、腹部皮膚等部位變藍(lán)。30～45 min后麻醉大鼠并暴露心臟，經(jīng)左心室快速灌注生理鹽水至流出液變清，斷頭取腦，用4℃生理鹽水沖洗腦組織，濾紙吸去殘余水分。1 ml/100 mg 腦組織中加入甲酰胺溶液，60 ℃避光水浴48 h，5 000 r/min(r=10 cm)離心20 min，酶標(biāo)儀(ELx808，BioTek，Winooski，VT，USA)于620 nm波長測光密度值，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品內(nèi)EB含量(μg/ml)，并按以下公式計(jì)算腦組織內(nèi)EB含量。腦組織內(nèi)EB含量(μg/g)= 樣品EB含量(μg/ml)× 甲酰胺體積(ml)/腦組織重量(g)。

1.5 透射電鏡觀察

1.5.1 灌注固定液制備 電鏡灌注固定液(0.25%戊二醛+4%多聚甲醛)：10%多聚甲醛 200 ml，0.2 mol/L 磷酸緩沖液 250 ml，50%戊二醛水溶液 2.5 ml，雙蒸水加至500 ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

電鏡固定液(2.5%戊二醛+2%多聚甲醛)：10%多聚甲醛20 ml，0.2 mol/L 磷酸緩沖液50 ml，50%戊二醛水溶液5 ml，雙蒸水加至100 ml。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 電鏡標(biāo)本制備及觀察 按上述方法行大鼠頸動脈給藥，注意觀察大鼠生命體征。分別取正常對照組、0.5 h、3 h、6 h、24 h組大鼠，麻醉后迅速開胸并暴露心臟，經(jīng)左心室快速灌注低溫生理鹽水至流出液變清，再用200 ml灌注固定液快速灌注固定。斷頭取腦，冰上操作，快速將皮質(zhì)腦組織分割成1 m3的小組織塊，置于2.5%戊二醛+2%多聚甲醛固定液中，4 ℃存放。PBS漂洗，1%鋨酸浸泡2 h以達(dá)到后固定。PBS漂洗，分別于70%、80%、90%丙酮溶液中浸泡15 min，最后置于100%丙酮浸泡10 min(此步驟重復(fù)一次)。Epon812環(huán)氧樹脂混合液包埋標(biāo)本，制成90 nm超薄切片。醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色。透射電鏡(H-7650，日本，HITACHI 公司)下觀察標(biāo)本并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 碘佛醇對血腦屏障通透性的影響 對腦組織EB含量的定量測定表現(xiàn)出與我們之前的研究一致的結(jié)果，即與正常對照組相比，給藥后0.5 h腦組織內(nèi)EB含量無明顯差異(P>0.05)；給藥后3 h腦組織內(nèi)EB含量有所增加，給藥后6 h組腦組織EB含量最高(均P<0.01)，24 h時(shí)EB含量顯著下降，仍高于正常對照組(P<0.01)，但趨于正常(見圖1)。與正常對照組相比，不同時(shí)間點(diǎn)生理鹽水組腦組織內(nèi)僅有微量EB，且無明顯差異(P>0.05)(見圖1)。

給予碘佛醇和生理鹽水后不同時(shí)間大鼠腦組織 EB 含量比較**P<0.01 vs 正常對照組(每組大鼠n=3)

2.2 碘佛醇對血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的影響 正常對照組：腦皮質(zhì)組織內(nèi)皮細(xì)胞扁平，TJs結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞周圍有較厚基板(見圖2A)；給藥后0.5 h組：內(nèi)皮細(xì)胞扁平，TJs結(jié)構(gòu)基本清晰，細(xì)胞周圍基板基本完整(見圖2B)；給藥后3 h組：內(nèi)皮細(xì)胞扁平或不規(guī)則，血管腔變形，TJs結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞周圍基板結(jié)構(gòu)疏松，血管周圍可見水腫液聚集(見圖2C)；給藥后6 h組：內(nèi)皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，部分血管腔變形、閉塞，TJs結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞周圍基板間斷溶解，血管周圍可見水腫液聚集(見圖2D)；給藥后24 h組：內(nèi)皮細(xì)胞扁平，TJs結(jié)構(gòu)基本清晰，細(xì)胞周圍基板基本完整(見圖2E)。圖2中D1顯示給藥后6 h，大鼠腦皮質(zhì)組織血管腔明顯變形、閉塞，血管周圍可見大量水腫液聚集。

A：正常對照組；B：給藥后0.5 h組；C：給藥后3 h組；D：給藥后6 h組；E：給藥后24 h組，圖中箭頭所指為緊密連接結(jié)構(gòu)(每組大鼠n=3)

3 討 論

造影劑可引起急性、自限性皮質(zhì)盲、精神行為異常、癲癇發(fā)作、肢體癱瘓等神經(jīng)功能缺損[15～17]，部分患者可危及生命[18，19]。高血壓、糖尿病、腎損害、超劑量應(yīng)用造影劑和既往造影劑過敏可增加 CIE發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[20]。雖然CIE 的發(fā)生與造影劑的滲透壓或離子狀態(tài)無關(guān)，但不同造影劑引起的CIE臨床表現(xiàn)不同[16，17]。研究表明，碘佛醇是一種低滲性、非離子單體碘造影劑，對腦小動脈、毛細(xì)血管和小靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞滲透作用較小，普遍認(rèn)為具有良好的安全性和耐受性，但其腦損害仍有報(bào)道[16，17，21]。然而，碘佛醇引起的CIE的發(fā)生機(jī)制尚未闡明，可能與腦血管痙攣、BBB破壞、血栓栓塞及自身免疫反應(yīng)有關(guān)，其中，BBB破壞可能發(fā)揮重要作用[12，22，23]。

本研究發(fā)現(xiàn)，造影劑的腦損害可能具有用藥時(shí)間依賴性；頸動脈注射碘佛醇后0.5 h、3 h、6 h和24 h，各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦內(nèi)EB 含量存在先增高后降低的趨勢，腦內(nèi)EB含量在用藥6 h最高；EB 含量的變化與TJs超微結(jié)構(gòu)完整性的改變趨勢一致。

臨床發(fā)現(xiàn)，CIE 多發(fā)于用藥后數(shù)小時(shí)，且多于 24～48 h 內(nèi)恢復(fù)正常[17，19，20]。本研究提示，造影劑的腦損害可能具有用藥時(shí)間依賴性。頸動脈注射碘佛醇后0.5 h，BBB并未發(fā)生改變，用藥 3 h BBB 通透性開始升高，至6 h 達(dá)到高峰，此后逐漸下降，至24 h尚未恢復(fù)但趨于正常。同時(shí)，我們采用透射電鏡觀察BBB超微結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示，給藥后0.5 h組 BBB 超微結(jié)構(gòu)較正常對照組變化不大，而給藥后3 h和6 h組 BBB 結(jié)構(gòu)明顯破壞，其中6 h組內(nèi)皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，TJs結(jié)構(gòu)更加模糊，細(xì)胞周圍基板間斷溶解；給藥后24 h組 BBB 結(jié)構(gòu)類似0.5 h組，與正常對照組形態(tài)結(jié)構(gòu)相比沒有顯著的變化。這與 EB 染色的結(jié)果大抵相同，共同印證了短時(shí)間內(nèi)造影劑的使用會增加 BBB 通透性的觀點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)碘佛醇對大鼠 BBB 通透性的影響。提示在臨床工作中，用藥后6 h可能是 CIE發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。

BBB作為維持CNS穩(wěn)態(tài)的重要結(jié)構(gòu)，其功能障礙與許多CNS疾病的發(fā)生密切相關(guān)。這種障礙可能是短暫、輕度的 TJs 開放，也可能是慢性持續(xù)性的 BBB 破壞，甚至可以引起轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的改變。研究表明，缺血、缺氧、腫瘤、感染等因素會引起TJs的結(jié)構(gòu)和功能變化，導(dǎo)致 BBB 通透性改變，引起腦水腫、神經(jīng)炎性反應(yīng)、神經(jīng)功能缺損等[3，24]。本研究從形態(tài)學(xué)角度發(fā)現(xiàn)頸動脈注射碘佛醇后大鼠腦內(nèi)TJs的結(jié)構(gòu)改變，結(jié)合我們既往對TJs蛋白的研究[14]，進(jìn)一步證實(shí)注射碘佛醇后引起TJs開放對BBB通透性的影響。因此，早期針對TJs的干預(yù)可能是CIE防治的關(guān)鍵點(diǎn)。然而，BBB 的開放具有雙重意義，嚴(yán)重持續(xù)的病理損害可以導(dǎo)致疾病的發(fā)生，但短暫、定向、適度的開放有助于部分CNS疾病的治療[25]。碘佛醇引起的大鼠BBB的改變，呈現(xiàn)為短暫、可逆性的開放，也許為 BBB 開放及 CNS 疾病藥物傳遞提供了一種新思路。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，單次注射碘佛醇后可誘發(fā)腦血管痙攣。在給藥后6 h組，本研究發(fā)現(xiàn)，腦小血管的管腔發(fā)生明顯變形，甚至閉塞，提示腦小血管腦血管痙攣與 BBB 破壞可能共同參與了造影劑腦損害的發(fā)生、發(fā)展過程，值得進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，頸動脈注射碘佛醇后可引起大鼠 BBB時(shí)間依賴性通透性及超微結(jié)構(gòu)的可逆性改變，BBB通透性的動態(tài)變化與TJs的超微結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，從形態(tài)學(xué)角度反映了BBB破壞參與CIE的發(fā)病機(jī)制。