let-7a1和let-7c在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

李殿明，柳兆飛，寧國蘭

肺癌是目前發病率與病死率最高的惡性腫瘤，死亡率高主要是由于絕大部分病人確診時已屬中晚期，5年生存率極低[1]。因此，肺癌的早期診斷和有效的治療方法是改善預后和提高生存率的關鍵。近年來，一些研究發現微小RNA(microRNA，miRNA)能調節多種腫瘤的發生、發展及轉移等[2]。循環miRNAs可作為肺癌診斷標記物[3]，還可在預測腫瘤治療反應、療效評價[4]及預后[5]等方面起到重要作用。

miRNA廣泛存在于真核生物中，是一種在進化中高度保守的短鏈非編碼RNA[6]。let-7是人體內第一個被發現的miRNA，包含13個成員：let-7-a-1/2/3，let-7-b，let-7-c，let-7-d，let-7-e，let-7-f-1/2，let-7-g，let-7-i，mir-98和mir-202[7]。let-7家族是目前研究最多的miRNA之一，研究[8-10]發現其在多種腫瘤中表達下調，可能作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發生、發展。關于let-7與腫瘤的研究大多集中在let-7a和let-7b上，關于let-7c的研究較少，而且let-7a1和let-7c共同在肺癌中的研究，至今未見報道。

本研究通過檢測肺癌組織、癌旁正常組織和良性肺疾病組織中let-7a1和let-7c基因的表達，分析兩者與肺癌發生、發展的相關性，探討其在肺癌發生中可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑 (Invitrogen公司)；RNA保存液[(天根生化科技(北京)有限公司)；DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術公司)]；EB(北京天根生化科技有限公司)；All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR檢測試劑盒(廣州復能)；let-7a1、let-7c基因引物、U6內參引物(廣州復能)；SuperScript Ⅲ反轉錄試劑盒(ABI-invitrogen)；Sybr qPCR 試劑盒(ABI-invitrogen)。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(蘇州市凈化設備有限公司)；Finnpipette各型移液器(芬蘭ABI-invit rogen)；7500型PCR儀(美國 ABI 公司)；AlphaView圖像分析軟件(美國Alpha公司)；Eppendor 5810R型冷凍高速離心機(德國Eppendorf 公司)；瓊脂糖水平電泳槽(美國Bio-Rad公司)；MK200-1型干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)；XW-80A型漩渦混合器(上海醫科大學儀器廠)；VCR76X5型振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.1.4 引物設計 PCR反應所用的下游引物為試劑盒提供的通用引物，上游引物是廣州復能基因提供的All-in-OneTMmiRNA qPCR引物；let-7a的上游引物序列號為HmiRQP0002；let-7c的上游引物序列號為HmiRQP0006；U6的上游引物序列號為HmiRQP9001。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 按說明書進行，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性，28S/18S≥2，說明RNA完整性良好(見圖1)。使用分光光度計測定樣品OD值，經紫外分光光度儀分析OD260/OD280，OD260/OD280值均為1.8～2.0。

1.2.2 熒光定量PCR 染料法熒光定量PCR 檢測組織中miRNA表達。因成熟let-7很短，只有22 nt，而且其末端不具有mRNA所有的多聚腺苷酸尾巴，所以普通逆轉錄試劑盒中的隨機引物和Olig(dT)引物幾乎不能對其進行逆轉錄。因此，在逆轉錄前需對其尾端進行加工修飾，本研究選擇加尾法修飾進行逆轉錄，首先利用ploy(A)酶在其尾端進行加尾反應，產物類似mRNA，然后再利用Olig(dT)引物對其進行逆轉錄，確保熒光定量PCR的特異性。

按All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR檢測試劑盒加尾法逆轉錄和PCR試劑盒說明書步驟進行，PCR儀器程序參數設置如下：預變性95 ℃、10 min，1個循環；變性95 ℃、10 s，退火60 ℃、24 s，延伸72 ℃、34 s，共40個循環。擴增結束后直接做溶解曲線檢測 PCR 產物的特異性。以cDNA為模板，U6為內對照，檢測各標本的let-7a1和let-7c的相對表達水平。

1.2.3 PCR產物的判定和計算 50×ROX Reference Dye是熒光定量PCR常用的DNA結合染料。因染料法與雙鏈DNA結合并不是一一對應，一旦有引物二聚體形成或非特異性擴增都將影響結果。所以通過溶解曲線分析判斷PCR反應的特異性。最終以內參校正的相對值作為后期統計分析數據。

1.6 統計分析 數據由雙人錄入，建立數據庫，采用SPSS 16.0統計軟件進行數據處理，計數資料采用百分比描述，計量資料采用均數±標準差描述，構成比的比較采用卡方檢驗。

使用ABI公司的StepOnePlusTM(96孔)實時熒光PCR擴增儀進行實時熒光定量PCR反應，檢測各八連管中cDNA的Ct值(C代表熒光信號到達閾值時所需要的PCR反應次數，t代表循環閾值)，實驗設3個復孔，取平均值，以組織中U6的表達作為內參進行相對定量，采用2-△△Ct值法計算2種miRNA在組織中的相對表達量。公式：△Ct=Ct(let-7)-Ct(U6)，△△Ct=△Ct(實驗組織)-△Ct(對照組織)。

1.3 統計學方法 采用t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 肺腺癌和鱗癌的病理診斷及免疫組織化學標記結果 肺腺癌病理顯示腫瘤結節狀生長，浸潤周圍肺組織；低倍鏡下癌細胞呈不規則腺管狀排列，在膠原纖維間浸潤性生長。免疫組織化學結果顯示癌細胞表達TTF1、CK7、NapsionA(見圖2)。肺鱗癌病理顯示不規則結節狀生長，與周圍肺組織界限不清；低倍鏡下癌細胞呈大小不一的巢團狀生長，可見小的角化珠及細胞內角化，間質膠原化。免疫組織化學結果顯示瘤細胞表達p63、p40(見圖3)。

2.2 let-7a1和 let-7c基因在肺癌組織、癌旁正常組織和良性肺疾病組織中的表達的擴增曲線Line圖和溶解曲線圖 熒光定量PCR擴增曲線呈較為光滑的S型，均在30個循環以前出現擴增信號，結果較為可靠；由于產物序列不同，溶解曲線熒光信號主峰基本集中在80～90 ℃和78～88 ℃，其前有小的雜峰，考慮為復空中底物濃度過低所至引物二聚體的形成(見圖4～7)。

2.3 let-7a1和let-7c基因在肺癌組織、癌旁正常組織和良性肺疾病組織中的表達比較 肺癌組織中let-7a1和let-7c的相對表達量均低于癌旁正常組織和良性肺疾病組織(P<0.05)；癌旁正常組織中let-7a1和let-7c的相對表達量均低于良性肺疾病組織(P<0.05)(見表1)。

表1 肺癌組織、癌旁正常組織和良性肺疾病組織中let-7a1、let-7c基因的表達比較

2.4 let-7a1和let-7c基因在不同病理類型肺癌組織中的表達比較 let-7a和let-7c基因在肺鱗癌和腺癌中的相對表達量差異均無統計學意義(P>0.05)(見表2)；在肺鱗癌和腺癌旁正常組織中的相對表達量差異也均無統計學意義(P>0.05)(見表3)。

2.5 let-7a1和let-7c表達與肺癌臨床特征之間的關系分析 let-7a1表達與分化程度、吸煙和TNM分期有關(P<0.05～P<0.01)，與淋巴結有無轉移無關(P>0.05)。let-7c表達與淋巴結轉移、分化程度有關(P<0.01)，與吸煙、TNM分期無關(P>0.05)(見表4)。

表2 let-7a1和let-7c基因在不同病理類型肺癌組織中的表達比較

表3 let-7a和let-7c基因在不同病理類型肺癌旁正常組織中的表達比較

3 討論

肺癌是發病率及死亡率最高的癌癥，2018年全球肺癌新發病例達到209萬余例，肺癌相關死亡病例高達176萬余例，同年我國統計數據顯示約有77.4萬的新增肺癌病例，其中69萬人死于肺癌[11]。非小細胞肺癌占肺癌的80%～90%，而小細胞癌在過去20多年里在許多國家的發病率一直在下降[12]。對于非小細胞肺癌，近年來盡管采用了手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，其5年生存率僅15%[13]。靶向和免疫治療一直是肺癌領域研究的熱點，但也存在較多問題，靶向治療主要針對有EGFR、ALK、c-MET、ROS1等突變的病人，但仍有大約有一半的非小細胞肺癌病人無明確靶點，同時靶向治療耐藥不可避免；免疫治療開創腫瘤治療新紀元，一旦獲益可能長期生存，但獲益率僅20%左右[14]，且有一定不良反應。因此，進一步闡明肺癌發展演變過程中分子機制，提高靶向和免疫治療的療效將對治療肺癌具有重大意義。

本研究通過熒光定量PCR檢測肺癌組織中let-7a1、let-7c的表達情況并結合臨床資料，分析其可能的分子機制。結果顯示，肺癌組織中let-7a1和let-7c基因表達低于癌旁組織和正常肺組織，差異有統計學意義；但在腺癌、鱗癌組織及其癌旁組織中表達，差異均無統計學意義；這與尚學芹等[15]研究結果一致，也與其在其他腫瘤組織中的表達結果一致[16-17]。但FASSINA等[18]研究認為，在腺癌組織中let-7a、let-7b、let-7c、let-7f、let-7g、let-7i和miR-98的表達量明顯高于鱗癌組織，考慮本研究所使用的均為手術標本，均經嚴格的標本清洗及儲存處理，而且本研究樣本量44例高于FASSINA等研究的所采用的針吸標本組織31例，故認為本研究結果更可信。

表4 let-7a-1和let-7c基因與各臨床相關指標之間的關系

本研究結果顯示，Let-7c在肺癌組織中的表達與淋巴結轉移、分化程度有關，與ZHAO等[19]的報道一致，也與耿淼等[20]在乳腺癌和ZHU等[21]在肝癌細胞中體外及體內實驗結果一致，但具體作用機制有待進一步研究。ZHAO等[19]認為肺癌的轉移與let-7c下游靶基因整合素β3和絲裂原蛋白激酶激酶激酶激酶3有關，這給肺癌的淋巴結轉移途徑研究提供新的證據。對于本研究發現的let-7c與吸煙、TNM分期無關，尚未見文獻報道，其發生機制我們將進一步探討。與之不同的是let-7a1則與吸煙、TNM分期明顯相關，而與淋巴結轉移無關。另外let-7a1在肺癌中的表達隨分化程度越差其表達明顯減低。同時本研究結果還顯示，let-7a1表達在一定程度上與吸煙相關，有吸煙史者表達減低，這與IZZZOTTI等[22]研究的煙草暴露環境中小鼠的肺組織上皮細胞let-7表達下降的結果基本一致。

目前關于let-7在肺癌中的治療價值主要集中在以下幾方面：(1)含鉑兩藥方案一直是肺癌的標準化療方案，但有效率較低，客觀緩解率為29.2%～36.4%[23]。最近有研究[24]認為肺癌細胞對鉑類藥物的耐藥可能也與let-7和miR-29對Cockayne syndrome protein B的調節有關。(2)針對非小細胞肺癌中上調let-7基因的研究認為高遷移率族蛋白A2 mRNA是let-7b的功能性小分子RNA，在HCC827細胞的的體內外研究結果都表明能使其特異性沉默，因此認為let-7可能是潛在的腫瘤治療靶點[25]。另有研究[26]發現miR-203通過抑制LIN28B和促進let-7的生物合成，在抑制肺癌細胞增殖和促進凋亡方面發揮了重要作用。(3)靶向治療一直是非小細胞肺癌治療的熱點，特別是EGFR-TKIs的臨床應用，給病人帶來了無進展生存期的獲益，改善了生活質量，但耐藥不可避免，其分子機制尚不清楚。有研究[27]報道與吉非替尼敏感PC9細胞相比，吉非替尼耐藥PC9/GR細胞let-7家族表達下調，miR-17家族表達上調。let-7和miR-17參與了非小細胞肺癌EGFR-TKI耐藥的調控，可作為預測非小細胞肺癌EGFR-TKI耐藥的生物標志物。(4)免疫檢查點抑制劑是腫瘤治療的一個最有前途的靶點，但客觀應答率小于40%，并且對PD-1/PD-L1表達調控的機制知之甚少。CHEN等[28]研究發現let-7能夠抑制PD-L1表達，而LIN28是一種RNA結合蛋白，在大多數癌細胞中上調，抑制let-7的生物合成，從而促進PD-L1的表達。因此，抑制LIN28可能是預防癌細胞免疫逃逸的一種策略。因此let-7已成為腫瘤治療和免疫應答的關鍵分子，本身也具有潛在的免疫治療靶點作用[29]。

LI等[30]通過Meta分析探討microRNA let-7在肺癌中的預后作用也發現let-7的低表達提示整體生存率低，危險比為1.55(95%CI：1.16～2.09，P<0.05)。let-7的低表達與肺癌病人預后不良密切相關。

綜上，let-7a1和let-7c基因在肺癌組織中低表達，并且隨臨床分期進展、淋巴結轉移呈明顯下降趨勢，提示兩者與肺癌的發生、發展及轉移密切相關，let-7a1和let-7c可能成為肺癌早期診斷生物標記因子，并可能成為肺癌的靶向治療新的靶點，為高危人群的早期干預提供實驗依據。