芡種殼多酚超聲輔助提取工藝優(yōu)化及其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果

張柳婷　呂金月　張港　李亞濤　蔡梅紅　段玉清

摘要：【目的】優(yōu)化芡種殼多酚提取工藝，并分析其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用和抑菌穩(wěn)定性，為芡種殼的資源化利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎贸曒o助法提取芡種殼多酚，以多酚提取率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)超聲時(shí)間（X1）、超聲溫度（X2）和料液比（X3）3個(gè)因素進(jìn)行單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最佳提取工藝，初步純化;采用瓊脂擴(kuò)散法研究芡種殼多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性，并測(cè)定最小抑菌濃度（MIC），同時(shí)考察溫度、pH及金屬離子濃度對(duì)芡種殼多酚穩(wěn)定性的影響?！窘Y(jié)果】3個(gè)因素對(duì)芡種殼多酚提取率影響的大小為：超聲溫度>料液比>超聲時(shí)間，料液比及超聲溫度與料液比的交互作用對(duì)芡種殼多酚提取率有顯著影響（P<0.05），超聲溫度對(duì)多酚提取率有極顯著影響（P<0.01）。得到回歸方程Y=14.57+0.064X1+0.26X2+0.11X3+0.079X1X2-0.018X1X3-0.18X2X3-0.11X12-0.54X22-0.19X32;最佳提取工藝為：超聲時(shí)間39 min、超聲溫度72 ℃、料液比1∶41，在此條件下，芡種殼多酚提取率為14.479%，與預(yù)測(cè)值（14.630%）接近;芡種殼多酚對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯抑制作用，MIC為0.1625 mg/mL;溫度及Ca2+、Mg2+、K+、Na+ 4種金屬離子對(duì)芡種殼多酚抑制金黃色葡萄球菌活性不具有顯著影響（P>0.05），而隨著pH的增加，芡種殼多酚抑菌活性受到抑制?！窘Y(jié)論】采用優(yōu)化的超聲輔助法可有效提取芡種殼中多酚物質(zhì)，提取到的多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的生長具有良好且較穩(wěn)定的抑制效果。

關(guān)鍵詞： 芡種殼;多酚;超聲輔助法;抑菌;金黃色葡萄球菌

中圖分類號(hào)： S509.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）01-0189-09

Abstract：【Objective】The extraction technology of polyphenols from Euryale ferox seed shell was optimized， and its inhibition and stability to Staphylococcus aureus were analyzed to provide basis for resource utilization of E. ferox seed shell. 【Method】The ultrasonic assisted extraction method was used to extract the polyphenols from E. ferox seed shell. The single factor experiment and response surface experiment with extraction yield of polyphenols（Y） as the evaluation index， and the ultrasound time（X1）， ultrasound temperature（X2） and soild-liquid ratio（X3） as three factors were carried out to determine the best extraction process， then the extract was preliminarily purified by macroporous resin. The inhibitory activity and the minimum inhibitory concentration（MIC） of E. ferox seed shell polyphenols on S. aureus was studied by agar diffusion method. The effects of temperature，pH and metal ion concentration on the stability of polyphenols were also investigated. 【Result】The effects of three factors on yield of polyphenols from E. ferox seed shell were：ultrasound temperature>solid-liquid ratio>ultrasound time，the results showed that the solid-liquid ratio， and the interaction between ultrasound temperature and solid-liquid ratio had significant effects on yield of polyphenols（P<0.05）， while the ultrasound temperature had extremely significant effects（P<0.01） on the extraction rate of polyphenols from E. ferox seed shell. The regression equation was obtained：Y=14.57+0.064X1+0.26X2+0.11X3+0.079X1X2-0.018X1X3-0.18X2X3-0.11X12-0.54X22-0.19X32. The optimum extraction process was： ultrasound time was 39 min，ultrasound temperature was 72 ℃，solid-liquid ratio was 1∶41. Under these conditions，the extraction rate was 14.479%， which was close to the predicted value（14.630%）. E. ferox? seed shell polyphenol had certain inhibitory effect on S. aureus，the MIC was 0.1625 mg/mL. The temperature and Ca2+， Mg2+， K+ and? Na+? metal ions had no significant effect on the inhibition of S. aureus reproductive activity by E. ferox seed shell polyphenols（P>0.05）， but with the increase of pH， the bacteriostatic activity of E. ferox seed shell polyphenols was inhibited. 【Conclusion】The polyphenols in the shell of E. ferox can be effectively extracted by the optimized ultrasonic assisted method，and the polyphenols has a good and stable inhibitory effect on the growth of S. aureus.

Key words： Euryale ferox seed shell; polyphenols; ultrasonic assisted method; antimicrobial activity; Staphylococcus aureus

Foundation item： Jiangsu Modern Agriculture Industrial Technical System Project（JATS〔2019〕469）

0 引言

【研究意義】芡（Euryale ferox）為雙子葉植物綱睡蓮科一年生大型水生草本植物，俗稱雞頭、肇實(shí)和雁頭。芡的種子包括種殼（芡種殼）和種仁（芡實(shí)）兩個(gè)部分，其中，芡實(shí)主要組分為淀粉（王晶，2011;劉志國和趙文亞，2012;Zhang et al.，2019），還富含蛋白質(zhì)（張名位等，1999;黎衛(wèi)，2015）、多酚（Liu et al.，2013）、礦物質(zhì)（張名位等，1999）和維生素等物質(zhì)，其味甘，性平，主治濕痹、腰脊膝痛，補(bǔ)中，除暴疾，益精氣，強(qiáng)志，是一種傳統(tǒng)藥食同源的食材;芡種殼是芡實(shí)種仁外一層厚1～2 mm的堅(jiān)硬外殼，占芡種子質(zhì)量的40%～50%。目前在芡的加工過程中，大量芡種殼被當(dāng)作廢棄物燒毀，或被丟棄后占用耕地堆放腐爛，且日曬雨淋，酸性物質(zhì)污染土壤和河流，造成土地酸化，導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境問題;芡種殼中含有豐富的多酚（張汆等，2015）、萜類（Yuan et al.，2014）和礦物元素（陳德義等，2015），這些活性物質(zhì)未得到合理利用，造成很大的資源浪費(fèi)。因此，若能提取芡種殼中的多酚物質(zhì)，研究其抑菌活性，進(jìn)一步將其應(yīng)用于食品防腐保鮮等領(lǐng)域，對(duì)芡種殼的資源化利用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前對(duì)芡生理活性物質(zhì)提取及其活性的研究已有不少相關(guān)報(bào)道。芡實(shí)的提取物可通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位和活性氧的產(chǎn)生誘導(dǎo)A549癌細(xì)胞的凋亡（Nam et al.，2019）;芡實(shí)的乙酸乙酯提取物可抑制小鼠黑色素的產(chǎn)生（Baek et al.，2015），其石油醚提取組分對(duì)小鼠抑郁有一定抵抗作用（Huang et al.，2018）;此外，芡的一些成分具有明顯抗氧化活性，Liu等（2013）采用響應(yīng)面法提取肇芡種殼中的多酚，研究發(fā)現(xiàn)其具有一定抗氧化作用;從芡葉柄和花梗中提取的多糖和種子中提取得到的奎寧均可通過清除自由基起到調(diào)節(jié)血糖、預(yù)防糖尿病的功效（Song et al.，2011;Wu et al.，2017），對(duì)心肌缺血再灌注損傷也有一定效果（Das et al.，2006）;相關(guān)研究還表明芡種殼乙醇提取物中富含的三萜類物質(zhì)對(duì)糖尿病具有治療效果（Yuan et al.，2014）。對(duì)芡抑菌活性方面的研究，李成良（2011）研究發(fā)現(xiàn)芡實(shí)的醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌等8種菌株均有不同程度的抑菌效果;黎衛(wèi)（2015）對(duì)芡實(shí)蛋白進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)SDS處理的清蛋白對(duì)大腸桿菌抑制作用良好;張汆等（2015）對(duì)不同溶劑芡種殼提取物的抑菌活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取物較乙醇提取物和水提取物的抑菌活性更強(qiáng)，并發(fā)現(xiàn)幾種提取物對(duì)大腸桿菌O157、阪崎腸桿菌和單增李斯特菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，植物多酚的抑菌活性受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，其抑菌效果得到廣泛認(rèn)同（趙毅，2015;Xiong et al.，2017），但針對(duì)芡種殼中活性成分多酚提取工藝及其抑菌活性的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取芡種殼中多酚物質(zhì)的工藝條件，以常見的食品腐敗菌——金黃色葡萄球菌為典型菌種，研究芡種殼多酚對(duì)其的抑制作用，同時(shí)考察溫度、pH及金屬離子濃度對(duì)芡種殼多酚抑菌活性穩(wěn)定性的影響，為芡種殼多酚在抑制食品腐敗相關(guān)細(xì)菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

芡種殼購自安徽芡實(shí)大市場，烘干粉碎后過100目篩備用;金黃色葡萄球菌ATCC6538由江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存;AB-8樹脂購自東鴻化工有限公司，無水乙醇、無水碳酸鈉、氯化鈉和瓊脂粉等試劑均為國產(chǎn)分析純，福林酚購自上海源葉生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：發(fā)散式三頻平板式超聲設(shè)備（江蘇大學(xué)自制）、VIS-7220N可見分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）、藥材調(diào)料高速粉碎機(jī)（溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠）和恒溫?fù)u床（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 多酚含量測(cè)定

1. 2. 1. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林酚法（Singleton et al.，1999）測(cè)定總酚含量。配制1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別稀釋得到質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50和60 μg/mL的沒食子酸溶液，分別吸取500 μL不同質(zhì)量濃度的沒食子酸溶液，加入2.5 mL 10%福林酚試劑，在1～8 min內(nèi)加入2.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，充分混勻后室溫下避光1 h顯色，在760 nm波長下測(cè)其吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=0.0101x+0.0514（R2=0.9986）。

1. 2. 1. 2 多酚提取率計(jì)算 吸取一定量提取液，稀釋一定倍數(shù)，吸取其中500 μL稀釋液，加入2.5 mL 10%福林酚試劑，在1～8 min內(nèi)加入2.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，充分混勻后室溫下避光1 h顯色，在760 nm波長下測(cè)其吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到多酚質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算提取率：

多酚提取率（%）=[C×V×N×10-6m]×100

式中，C為芡種殼多酚質(zhì)量濃度（μg/mL），V為提取液體積（mL），N為稀釋倍數(shù)，m為芡種殼質(zhì)量（g）。

1. 2. 2 單因素試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取0.500 g芡種殼粉置于一定體積的水溶液中，在頻率40 kHz、功率300 W的超聲條件下提取一定時(shí)間。以8000 r/min速率進(jìn)行離心，取上清液，測(cè)定多酚質(zhì)量濃度，計(jì)算多酚提取率。以多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)超聲條件下芡種殼多酚提取率的影響。

1. 2. 2. 1 超聲時(shí)間對(duì)芡種殼多酚提取率的影響

分別設(shè)置超聲時(shí)間為5、15、25、35和45 min，在超聲頻率40 kHz、超聲溫度40 ℃、料液比1∶40的條件下進(jìn)行超聲水提，計(jì)算多酚提取率。

1. 2. 2. 2 超聲溫度對(duì)芡種殼多酚提取率的影響

分別設(shè)置超聲溫度為30、40、50、60、70和80 ℃，在超聲頻率40 kHz、超聲時(shí)間35 min、料液比1∶40的條件下進(jìn)行超聲水提，計(jì)算多酚提取率。

1. 2. 2. 3 料液比對(duì)芡種殼多酚提取率的影響 分別設(shè)置料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60，在超聲頻率40 kHz、超聲溫度70 ℃、超聲時(shí)間35 min的條件下進(jìn)行超聲水提，計(jì)算多酚提取率。

1. 2. 3 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)Box-Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)原則，以超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比3個(gè)因素為自變量，多酚提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中12個(gè)為析因試驗(yàn)，5個(gè)為中心試驗(yàn)。因素與水平見表1。

1. 2. 4 大孔樹脂提純 選用AB-8樹脂對(duì)芡種殼多酚進(jìn)行分離純化。用95%乙醇浸泡AB-8樹脂24 h，使其充分溶脹后，去離子水洗至無醇味;用5%鹽酸浸泡8 h，去離子水洗至中性;用5%氫氧化鈉浸泡8 h，去離子水洗至中性。去離子水浸沒備用。樹脂采用濕法裝柱，穩(wěn)定后上樣，上樣量200 mL，上樣速度2 mL/min，充分吸附后以70%乙醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，至流出液無樣品顏色即洗脫完成。洗脫后的多酚溶液進(jìn)行旋蒸揮發(fā)有機(jī)溶劑，凍干備用。

1. 2. 5 菌種活化及菌懸液制備 從-20 ℃冰箱取出保藏的金黃色葡萄球菌ATCC6538菌種，于LB固體培養(yǎng)基上劃線活化，在生化培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)過夜。進(jìn)行抑菌試驗(yàn)前，將活化分離的菌種轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期備用。

1. 2. 6 抑菌活性試驗(yàn)及最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定芡種殼多酚抑菌活性。具體操作參考Najdenski等（2013）的方法，略有修改：配制LB固體培養(yǎng)基，高壓滅菌后冷卻至50 ℃左右，按100 μL/150 mL比例混入培養(yǎng)好的菌液，混勻后倒平板，凝固后以滅菌的打孔器打孔。將凍干后的多酚配成2.6 mg/mL的多酚水溶液，倍比稀釋，分別加入孔內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，觀察培養(yǎng)皿中細(xì)菌生長情況，記錄抑菌圈直徑，打孔器直徑為6 mm，抑菌圈直徑大于6 mm時(shí)表示有抑菌效果，能產(chǎn)生抑菌效果的最低樣品濃度為MIC。

1. 2. 7 溫度對(duì)芡種殼多酚抑菌效果的影響 以凍干粉配制3 mg/mL的多酚水溶液原液，將其分別在20、40、60、80、100和120 ℃下處理20 min，以瓊脂擴(kuò)散法分析芡種殼多酚抑菌活性的變化情況，比較抑菌圈大小，研究芡種殼多酚抑菌活性對(duì)不同溫度的敏感性。

1. 2. 8 pH對(duì)芡種殼多酚抑菌活性的影響 以凍干粉配制3 mg/mL的多酚水溶液原液，調(diào)節(jié)pH，使其分別為2、4、6、7、8、10和12，以瓊脂擴(kuò)散法分析芡種殼多酚抑菌活性的變化情況，比較抑菌圈大小，研究芡種殼多酚抑菌活性對(duì)不同pH的敏感性。

1. 2. 9 金屬離子對(duì)芡種殼多酚抑菌活性的影響

以凍干粉配制2 mg/mL的多酚水溶液原液，分別添加食品中常見的幾種金屬離子——Ca2+、K+、Na+和Mg2+，并調(diào)節(jié)各金屬離子濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9和1.0 mol/L，以不加金屬離子的多酚原液為對(duì)照，以瓊脂擴(kuò)散法分析芡種殼多酚抑菌活性的變化情況，比較抑菌圈大小，研究芡種殼多酚抑菌活性對(duì)不同金屬離子的敏感性。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

各試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3次。采用SPSS 17.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析和方差分析，采用Sigmaplot 10.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 1. 1 超聲時(shí)間對(duì)芡種殼多酚提取率的影響 由圖1可知，隨著超聲時(shí)間的延長，芡種殼多酚提取率顯著提高（P<0.05，下同），在35 min時(shí)達(dá)最大值，35 min后多酚提取率趨于平穩(wěn)，無顯著變化（P>0.05，下同）。說明隨著超聲時(shí)間的延長，溶液中的多酚濃度已達(dá)飽和，可溶出多酚已基本全部溶出?？紤]到耗能問題，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇35 min的超聲時(shí)間進(jìn)行處理。

2. 1. 2 超聲溫度對(duì)芡種殼多酚提取率的影響 如圖2所示，隨著超聲溫度的升高，芡種殼多酚提取率顯著提高，當(dāng)超聲溫度超過70 ℃后，多酚提取率增加不顯著?？紤]到高溫對(duì)多酚穩(wěn)定性的影響及能耗問題，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇70 ℃的超聲溫度進(jìn)行處理。

2. 1. 3 料液比對(duì)芡種殼多酚提取率的影響 如圖3所示，料液比在1∶10～1∶40時(shí)，隨著溶劑體積的增加，芡種殼多酚提取率顯著提高，在料液比為1∶40時(shí)，多酚提取率達(dá)最大值;當(dāng)料液比小于1∶40后，多酚提取率無顯著提高，趨于平穩(wěn)。在料液比為1∶40時(shí)芡種殼多酚的提取更經(jīng)濟(jì)，且過高的溶劑體積會(huì)增大后續(xù)提純等試驗(yàn)過程的工作量，故在后續(xù)試驗(yàn)中選擇料液比1∶40進(jìn)行處理。

2. 2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 模型的建立及顯著性分析 應(yīng)用Design-Expert V8.0.6對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到擬合方程：Y=14.57+0.064X1+0.26X2+0.11X3+0.079X1X2-0.018X1X3-0.18X2X3-0.11X12-0.54X22-0.19X32。

方差分析結(jié)果（表3）顯示，上述回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9688，說明該模型擬合度較好，可以真實(shí)地描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系;且失擬性（P=0.1472）不顯著，說明回歸方程和實(shí)際結(jié)果較吻合，試驗(yàn)誤差小，因此可用該回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由表3還可知，超聲溫度對(duì)芡種殼多酚提取率的影響達(dá)極顯著水平（P<0.01），料液比及超聲溫度與料液比的交互項(xiàng)達(dá)顯著水平，超聲時(shí)間與超聲溫度、超聲時(shí)間與料液比的交互項(xiàng)不顯著。

2. 2. 2 因素間的交互作用 固定料液比為1∶40時(shí)，超聲溫度與超聲時(shí)間對(duì)芡種殼多酚提取率影響的響應(yīng)面和等高線如圖4所示。當(dāng)超聲溫度固定時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長，芡種殼多酚提取率變化幅度較小;當(dāng)超聲時(shí)間固定時(shí)，隨著超聲溫度的升高，芡種殼多酚提取率先升高后下降，變化幅度較超聲時(shí)間大。超聲溫度在70～75 ℃、超聲時(shí)間在35～45 min范圍內(nèi)出現(xiàn)最高響應(yīng)值。

固定超聲溫度為70 ℃時(shí)，料液比與超聲時(shí)間對(duì)芡種殼多酚提取率影響的響應(yīng)面和等高線如圖5所示。當(dāng)料液比固定時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長，芡種殼多酚提取率增加至一定程度后相對(duì)穩(wěn)定;當(dāng)超聲時(shí)間固定時(shí)，隨著料液比的減小，芡種殼多酚提取率先升高后有小幅下降。料液比在1∶40～1∶45、超聲時(shí)間在30～45 min范圍內(nèi)出現(xiàn)最高響應(yīng)值。

固定超聲時(shí)間為35 min時(shí)，料液比與超聲溫度對(duì)芡種殼多酚提取率影響的響應(yīng)面和等高線如圖6所示。料液比與超聲溫度的交互作用顯著，當(dāng)料液比固定時(shí)，隨著超聲溫度的升高，芡種殼多酚提取率先升高后下降;當(dāng)超聲溫度固定時(shí)，隨著料液比的減小，芡種殼多酚提取率先升高后下降，變化幅度相比超聲溫度較小。料液比在1∶40～1∶45、超聲溫度在70～75 ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)最高響應(yīng)值。

2. 2. 3 工藝優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 通過Design-Expert V8.0.6分析得出3個(gè)因素對(duì)超聲過程中芡種殼多酚提取率的影響排序?yàn)椋撼暅囟?料液比>超聲時(shí)間。通過模型預(yù)測(cè)的最佳提取條件為：超聲時(shí)間38.69 min、超聲溫度72.44 ℃、料液比1∶41.48，該預(yù)測(cè)模型最佳提取率為14.630%。為實(shí)際操作方便，提取條件修正為：超聲時(shí)間39 min、超聲溫度72 ℃、料液比1∶41，在此條件下，芡種殼多酚提取率為14.479%，接近預(yù)測(cè)值，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的芡種殼多酚超聲提取條件可靠。

2. 3 MIC測(cè)定結(jié)果

由圖7可知，芡種殼多酚對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制效果，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，抑菌作用隨著多酚質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng);多酚質(zhì)量濃度為0.0813 mg/mL時(shí)抑菌圈已無變化，以此法得到的芡種殼多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.1625 mg/mL。

2. 4 不同溫度對(duì)芡種殼多酚抑菌效果的影響

溫度對(duì)芡種殼多酚抑菌效果的影響如圖8所示，芡種殼多酚經(jīng)各個(gè)溫度處理20 min后，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果無顯著差異，說明在此情況下，芡種殼多酚的抑菌活性對(duì)溫度并不敏感，相對(duì)穩(wěn)定。

2. 5 不同pH對(duì)芡種殼多酚抑菌效果的影響

pH對(duì)芡種殼多酚抑菌效果的影響如圖9所示，pH為6時(shí)，芡種殼多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最明顯，在中性附近，其抑菌效果相對(duì)較好，而在偏酸和偏堿性時(shí)均有明顯下降，尤其在堿性環(huán)境中抑菌活性最弱，可能與多酚物質(zhì)在堿性條件下不穩(wěn)定有關(guān)。

2. 6 不同金屬離子對(duì)芡種殼多酚抑菌效果的影響

金屬離子對(duì)芡種殼多酚抑菌效果的影響如圖10所示，添加不同濃度金屬離子時(shí)，芡種殼多酚的抑菌活性均無顯著差異，可見Ca2+、Mg2+、K+和Na+ 4種常見的金屬離子并不會(huì)對(duì)芡種殼多酚在食品中的抑菌效果造成影響。

3 討論

本研究采用超聲輔助法對(duì)芡種殼多酚進(jìn)行提取，該方法是提取植物多酚常用手段之一，利用超聲波在液體中的強(qiáng)烈振動(dòng)及空化作用造成瞬時(shí)高溫高壓使細(xì)胞破裂，幫助溶劑進(jìn)入細(xì)胞，提取目標(biāo)物質(zhì)。這種提取方法操作簡便，縮短提取時(shí)間，提高提取效率，降低提取溫度和能耗。在采用超聲技術(shù)提取多酚時(shí)，影響提取效率的因素較多，超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲頻率、料液比等均會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響，其中，超聲時(shí)間、料液比和超聲溫度在影響提取率的同時(shí)對(duì)大規(guī)模加工時(shí)的能耗也有較大影響。本研究在考慮實(shí)際生產(chǎn)能耗的基礎(chǔ)上，固定40 kHZ超聲頻率和300 W功率進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，使用蒸餾水為溶劑，對(duì)超聲時(shí)間、料液比和超聲溫度3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝為：超聲時(shí)間39 min、超聲溫度72 ℃、料液比1∶41，在此條件下，芡種殼多酚提取率可達(dá)14.479%，與Liu等（2013）采用響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取得到的肇慶芡種殼多酚提取率（15.69%）相近，可能與芡的品種有關(guān)，也可能與提取工藝中所采用的溶劑有關(guān)。

在對(duì)芡實(shí)的抑菌活性方面，李成良（2011）從芡實(shí)籽粒中提取的類黃酮成分對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出一定抑制作用;張汆等（2015）采用芡種殼提取物對(duì)多種菌種進(jìn)行抑菌率測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌、單增李斯特菌和葡萄球菌等均有一定的抑制效果。本研究也發(fā)現(xiàn)，芡種殼多酚對(duì)金黃色葡萄球菌具有一定抑制作用。芡種殼多酚的MIC及其抑菌穩(wěn)定性尚未見報(bào)道，本研究通過瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)芡種殼多酚的抑制效果具有濃度依賴性，即抑制作用隨著多酚質(zhì)量濃度的減小而減弱，在多酚質(zhì)量濃度從2.6000 mg/mL降至0.1625 mg/mL時(shí)，抑菌圈直徑從18.3 mm縮小至7.1 mm，濃度降至0.0813 mg/mL后，不再有抑菌圈出現(xiàn)。經(jīng)不同溫度（20～120 ℃）處理，芡種殼多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果未發(fā)生顯著改變，表明對(duì)食品進(jìn)行普通加熱不會(huì)對(duì)芡種殼多酚在食品中的抑菌作用產(chǎn)生影響;添加0.1～1.0 mol/L的Ca2+、Mg2+、K+和Na+ 4種金屬離子后，芡種殼多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果也未發(fā)生明顯變化，常見食品中這些離子含量大多不超過此范圍，因此，常見食品的金屬離子環(huán)境并不會(huì)影響芡種殼多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用;在較高pH范圍時(shí)，芡種殼多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用有明顯下降，表明芡種殼多酚對(duì)堿性環(huán)境較敏感，可能是發(fā)揮活性的多酚物質(zhì)在堿性環(huán)境下其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化（韓雯雯，2012）。

研究發(fā)現(xiàn)芡種殼中的多酚物質(zhì)可能為綠原酸、兒茶素和沒食子酸等（Liu et al.，2013;張汆等，2015）;已有大量研究表明綠原酸、兒茶素、沒食子酸及其衍生物具有一定抑菌效果（Li et al.，2014;Wu et al.，2018;王娜等，2019），但芡種殼中發(fā)揮抑菌作用的活性物質(zhì)是多酚物質(zhì)還是多酚與其他物質(zhì)的絡(luò)合體，發(fā)揮活性的多酚是單種多酚還是多種多酚混合，需進(jìn)一步試驗(yàn)探究。芡種殼多酚的抑菌機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。在經(jīng)過安全試驗(yàn)驗(yàn)證后，芡種殼多酚有望作為一種天然食品防腐劑應(yīng)用于食品中，為實(shí)現(xiàn)芡種殼的資源化利用提供一定理論依據(jù)。

4 結(jié)論

采用優(yōu)化的超聲輔助工藝條件（超聲時(shí)間39 min、超聲溫度72 ℃、料液比1∶41）可有效提取芡種殼中多酚物質(zhì)，提取到的多酚對(duì)金黃色葡萄球菌生長具有良好且較穩(wěn)定的抑制效果，其活性對(duì)溫度和Ca2+、Mg2+、K+、Na+ 4種金屬離子相對(duì)穩(wěn)定而對(duì)堿性環(huán)境相對(duì)敏感。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）