絨毛染色體檢測應用于稽留流產原因探討中的價值分析

陳雪芹，馮媛

云南省曲靖市第一人民醫院婦科，云南曲靖 655000

通常情況下，自然流產主要指妊娠＜28 周、胎兒體 重＜1 kg，妊娠存在流產情況；其中妊娠在12 周內終止為早期流產[1]。 根據相關臨床統計顯示，自然流產的發生率為15%～40%， 而其中80%以上為發生在12 周內的早期流產[2]。 稽留流產的別名為過期流產，其主要指胚胎已死亡滯留在宮腔中，并且沒有有效排出，是自然流產的一種特殊類型。 引起稽留流產的因素繁多，主要因素包括遺傳因素、免疫相關因素、感染因素以及分娩環境和產婦心理因素等。 因此明確流產的具體原因并采取有效的干預措施具有重要意義，已有的研究表明，染色體異常是其中一個很重要的原因， 約有60%稽留流產為胚胎染色體異常引起， 而精確檢測流產組織核型，有利于尋找胚胎停育病因，從而將有助于尋找到流產發生的根源所在， 并通過對再次妊娠流產風險的預測，為后續的干預和治療提供重要的參考依據[3]。 研究對象為2018 年10 月—2020 年2 月于該院住院行流產術的孕早期稽留流產患者154 例，收集相關研究數據，對稽留流產患者的絨毛染色體及其危險因素進行了研究，為后續指導提供重要參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為方便選取于該院住院行流產術的孕早期稽留流產患者154 例，最低年齡16 歲，最高年齡43歲，胚胎停育孕周介于孕5～15 周之間。 納入標準:①全部患者均為稽留流產；②均有停經史或尿hCG 陽性,在流產前對產婦進行相關檢查發現胎兒已經停止發育；③均為知情自愿參加該次研究。 該研究通過該院倫理委員會批準。 排除標準:①孕期存在感染患者；②具有激素類藥物使用史患者；③具有有害物質接觸史患者；④具有內分泌疾病史患者。

1.2 方法

首先需要嚴格遵守無菌操作原則， 對患者實施清宮術，術后收集絨毛組織，劑量為10～20 mg，對其進行沖洗，共沖洗兩次，使用生理鹽水沖洗，連同母體血3 mL(EDTA 抗凝)，之后實施二代高通量測序。 基因組DNA提取使用德國QIA-GEN 公司生產的基因組DNA 提取試劑盒，按照試劑盒說明書進行。 使用高通量測序文庫進行試劑盒完成CNV 文庫構建， 構建完成的文庫使用美國KAPA SYBR FAST qPCR 試劑盒對文庫進行準確定量。 并且需要結合各個樣本文庫的濃度實施混合處理，將完場混合的文庫應用于高通量測序儀平臺上，展開全面測序工作，同時需要合理設置參數，其中最小精度=100 Kb，測序深度=1 X。 對于需要進行測定的相關序列，合理應用RUPA 軟件，將其與人類基因組進行高效匹配。 在這一環節，將人類基因組進行合理劃分，為多個區域，統計各個區域內樣本完全匹配的序列個數，結合研究所得結果對比值進行合理計算， 并通過特定算法明確樣本的拷貝數變異(CNVs)區域，進而明確待測定樣本染色體的實際情況。 之后需要對相應標準化Z值進行全面分析， 通過Z 值對染色體異常情況加以明確。 之后進行數據分析工作， 需要搜索基因變異數據庫、在線人類孟德爾遺傳數據庫等相關數據，明確CNV臨床價值。

1.3 觀察指標

對染色體檢測異常情況進行分析。將＜35 歲組和≥35 歲組絨毛染色體異常率進行比較。

1.4 統計方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件對數據進行分析, 計量資料以（）表示，組間比較采用t 檢驗；計數資料以頻數和百分率（%）表示，組間比較采用 χ2檢驗。 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標本獲取情況

共收集患者絨毛標本154 例，對全部患者實施DNA提取，高通量測序得到全部結果，檢測成功率為100%。

2.2 染色體檢測異常情況

154 例稽留流產患者絨毛組織中， 染色體異常89例，檢出率100%，其中60 例為數目異常，表現為非整倍體數目異常，3 例為雙色體，1 例為15 和18 三體異常共存。29 例為結構異常。孕婦年齡≥35 歲組和＜35 歲組的絨毛染色體異常率分別為75.71%（53/70）和30.95%（26/84）,組間對比，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表 1。

表1 兩組絨毛染色體異常率比較[n(%)]

2.3 染色體微缺失、微重復分析

微重復 3 例，為 10.34%（3/29）；微缺失 2 例（6.89%）。

3 討論

稽留流產的原因具有一定的復雜性， 導致其發生的最主要因素便是染色體發生異常[4]，對染色體異常的進行劃分， 主要分為數目方面的異常和結構方面的異常， 數目異常的主要類型為整倍體的變化和非整倍體變化，其中后者十分常見，發生風險較大[5]。 結構異常的主要類型分為缺失、重復等。 上述變化都會引發一些遺傳性反應，進而致使變異個體表型出現明顯變化，嚴重可能引發死亡[6]。

常規G 顯帶核型正常細胞中也存在變異的情況，主要為亞顯微結構的嚴重變異， 其主要內容為染色體的微缺失、微重復以及類型豐富的染色體DNA 拷貝數（Genomic copy number wariations, CNVs）[7]。 基因組中約有一部分變異為CNVs，絕大部分的CNVs 屬于良性，但是剩余的一小部分便是引發嚴重染色體病癥的重要因素。 CNVs 多因為干擾基因表達進而對妊娠造成不良影響，流產的風險非常高。 CNVs 的可能致病機制較多，主要為劑量效應及位置效應兩方面、 致使部分隱性致病基因暴露出來、形成新的融合基因，對妊娠造成嚴重的影響[8]。

稽留流產的主要原因是絨毛染色體異常， 兩者之間息息相關。 因此對臨床來說，全面檢測絨毛染色體具有重要的意義， 有助于臨床醫師及時了解流產的主要因素，有助于為后續妊娠提供重要的指導依據，價值明顯[9]。 下面該文對詳細方法進行概述:①如果結果存在明顯異常， 下一次妊娠則需要明確科學合理的產前診斷方法。 ②如果結果顯示正常或者染色體具有多態性，需要實施其他檢測，急需查明原因。 ③如果檢測結果顯示致病性具有未執行，需要對夫婦實施外周血檢測，明確其是否為遺傳因素影響所致。如果CNVs 通過健康父母遺傳，那么便不是染色體因素引發的流產，如果 CNVs 通過攜帶者雙親進行遺傳， 可通過輔助生育技術進行明確，如果為新發型，可能是主要致病因素，需要進行詳細咨詢，通過專業臨床醫師對家族史、遺傳史進行全面分析，了解CNVs 再發風險，為下次妊娠作正確指導[10]。

該文研究了154 例流產樣本的拷貝數變異以非整倍體改變為主。 根據該次研究結果可知，154 例稽留流產患者絨毛組織中，染色體異常89 例，檢出率100%，其中60 例為數目異常，表現為非整倍體數目異常，3 例為雙色體，一例為15 和18 三體異常共存。29 例為結構異常。 孕婦年齡≥35 歲組和＜35 歲組的絨毛染色體異常率分別為 75.71%（53/70） 和 30.95%（26/84）（P＜0.05）。 宋杰[11]等對61 例孕早期稽留流產絨毛應用高通量測序技術染色體檢測研究結果顯示， 孕婦年齡≥35歲組和＜35 歲組的絨毛染色體異常率分別為76.9%和51.4%，與該文研究結果一致。

基于對流產絨毛進行核型的全面分析， 該方法有助于對染色體異常情況進行檢測， 但是該方法對絨毛細胞的采樣具有較高的要求，培養成功率低，分辨率也低，難以得到滿意的結果[12]。近年來，臨床測序技術呈飛速發展的趨勢，進步明顯，高通量的基因測序技術開始得到廣泛應用，其處理數據量非常大，一次能夠對幾十萬到幾百萬個DNA 分子測定。 目前已從常規基礎科研實驗室的應用轉入臨床醫學的應用， 該項目將高通量基因測序技術用于稽留流產婦女絨毛染色體檢測，為臨床提供大樣本量的研究， 旨在為稽留流產的病因學研究積累數據，為指導婦女再生育提供遺傳學的依據。

綜上所述， 染色體異常是早期稽留流產的重要因素，高齡孕產會導致胚胎染色體異常發生率提高。 采取高通量測序技術效果確切， 有助于了解稽留流產的原因，為下一次良好妊娠提供有效指導。